蛋白酶抑制剂ApSerpin1调控百子莲胚性愈伤组织超低温保存冻存率的分子机制研究

Vitrification-based cryopreservation is the most effective technique for cryopreservation of Agapanthus praecox embryogenic callus (EC). In the previous research, applicant identified a gene from A. preacox named ApSerpin1, coding a LR-type serine protease inhibitor, differentially expressed in cryopreservation process. Application of its recombinant protein from E.coli significantly improved the survival rate of A. praecox EC for nearly 30%. In this study, we will further analysis the regulation mechanism of ApSerpin1 on programmed cell death process and oxidative response of A. praecox EC cryopreservation. For investigate its mode of action, immuno-gold localization was performed to identify the subcellular localization of ApSerpin1. Transgenic EC of ApSerpin1 overexpression and RNA interference were obtained to demonstrate its molecular function. Furthermore, the proteins-interaction between ApSerpin1 and different targeted proteins was to elucidate the functional mechanism in cryopreservation using CoIP, pull-down and BiFC techniques. This work aimed to lay the foundation of the theoretical basis of ApSerpin1 as a cryoprotectant additive and provide a reference solution for in vitro preservation of other biological samples.

玻璃化法超低温保存是百子莲胚性愈伤组织（EC）中长期保存的最佳途径。申请人前期研究发现，百子莲LR型丝氨酸蛋白酶抑制剂ApSerpin1在超低温保存中表达差异显著，其原核表达的蛋白是百子莲EC超低温保存的有效优化物质，使冻存率提高了近30%。本项目拟在已获得的ApSerpin1重组蛋白的基础上，通过生理生化检测揭示外源ApSerpin1对百子莲EC超低温保存中细胞程序性死亡和氧化响应机制的调控作用；应用免疫胶体金定位技术明确ApSerpin1的作用位点；构建ApSerpin1过表达和RNA干扰的百子莲转基因EC验证其分子功能；利用CoIP、pull-down、BiFC等技术通过基于互作关系阐明ApSerpin1调控百子莲EC超低温保存的分子机制，以期为ApSerpin1作为冷冻保护剂添加剂的开发奠定理论基础，最终实现生物样本的离体保存。

玻璃化保存液是超低温保存的核心技术，研发更普适、高效地冷冻保护剂具有重要意义。我们前期研究发现LR型Serpin具有冷冻保护剂的开发价值，本项目对ApSerpin1的分子功能和作用机制进行了研究。研究结果显示，在百子莲胚性愈伤组织（EC）中分别过表达和RNA干扰表达ApSerpin1，过表达材料的冻存率可提高18%，而siRNA材料的冻存率则降低12%。主要是由于ApSerpin1能够通过蛋白直接互作的方式抑制PCD的调控蛋白酶ApMC1，进而减弱超低温保存处理过程中线粒体膜电位的降低和PCD的发生程度，由于PCD的发生受到ROS的调控，在过表达材料中H2O2水平也显著低于野生型材料。ApSerpin1在胞内的作用位点响应不同的胁迫处理，正常情况下ApSerpin1主要定位于细胞质，少量位于细胞核；甲基紫精长时间诱导后蛋白富集在细胞膜弯曲形成的包袋状胞质内；超低温保存脱水处理后，在细胞器和细胞核中富集；恢复培养后则主要存在于细胞器和细胞质，细胞核中的蛋白明显减少。将ApSerpin1体外表达蛋白添加至植物玻璃化保存液PVS2中，能够显著提高植物材料的冻存率，但ApSerpin1不进入细胞，可能是改变了PVS2溶液的理化性质所致，后续研究将对PVS2溶液的热物性等方面进行检测。本研究拓展了植物PVS2冷冻保护剂的种类，为开发更普适、高效地冷冻保护剂奠定基础。