酒酒球菌SD-2a抗逆相关基因表达模式和功能的研究

Oenococcus oeni is the main start Wine of malolactic fermentation (Malolactic fermentation, MLF). It plays an important role in the Wine brewing industry. The study obtained the transcriptome information from Oenococcus oeni SD-2a mixed samples by using high-throughput sequencing technology, and analyze it with the bioinformatics. The DGE (Up-graded Digital Gene Expression) technique is used to analyze the expression of resistance gene of O.oeni SD-2a. Because the resistance genes play a key role in the O.oeni SD-2a acid and alcohol resistance process, the study will use model organism Escherichia coli to verify of the stress resistance function of resistance gene hsp 18 and clp family in O.oeni SD-2a. The aim of the study is to understand the resistance gene expression characteristics of Oenococcus oeni under the stress conditions, so as to improve the environmental stress in the viability and vigor, and provides the theory basis for the fermentation efficiency DVS lactic acid bacteria fermentation agent.

酒酒球菌 (Oenococcus oeni, O. oeni) 是葡萄酒苹果酸-乳酸发酵(Malolactic fermentation, MLF)的主要启动者，在葡萄酒酿造工业中的重要地位。研究通过利用高通量测序技术获得Oenococcus oeni SD-2a混合样本的转录组信息，并对其进行生物信息学分析。再利用升级版的DGE（Up-graded Digital Gene Expression）技术分析O.oeni SD-2a的抗逆基因的表达特征。由于抗逆相关基因在O.oeni SD-2a的抗酸和抗酒精过程中起关键性作用，实验将同时利用模式生物大肠杆菌验证O.oeni SD-2a的抗逆基因hsp 18基因和clp基因家族在抗逆过程中的功能。研究旨在揭示酒酒球菌胁迫条件下的抗逆基因表达特性，从而提高其在环境胁迫下的生存能力和活力，同时为直投式活性乳酸菌发酵剂的发酵效率提供了理论依据。

本研究采用RNA-Seq转录组测序技术研究酒酒球菌酸胁迫下基因的表达情况，分析酸胁迫应答基因的代谢通路，筛选显著差异表达基因在大肠杆菌及植物乳杆菌中进行表达，并对重组菌酸耐受性进行分析，主要结果如下：（1）随着酸胁迫时间的延长，酒酒球菌胁迫应答机制逐步开启；（2）GO富集分析发现，在酒酒球菌SD-2a受到酸胁迫处理后，在催化活性、锚定、膜、膜组分、代谢过程和细胞内过程等条目中的基因数目最多；（3）KEGG代谢通路分析发现，在碳水化合物代谢、氨基酸代谢和膜转运中富集到较多的差异基因；（4）为验证差异表达基因在O. oeni SD-2a中可能发挥的作用，选取在共表达网络中与其他基因关联度较高且介数较大的基因在大肠杆菌中进行异源表达验证。有9个外源基因在大肠杆菌中成功表达，其中1，4，7，9号基因的重组菌株酸耐受性显著提高。说明精氨基琥珀酸合酶、D-丙氨酸-聚磷酸二醇连接酶、磷酸转移酶系统IIC组分、酯酶基因可以显著提高大肠杆菌酸胁迫耐受性；（5）为进一步证明精氨酰琥珀酸合成酶基因（argG）在酒酒球菌酸胁迫应答机制中的作用，实现了argG基因在近缘菌株植物乳杆菌中的表达，酸胁迫耐受性发现，重组菌株在酸胁迫环境中表现出较强的生长性能，其中，重组菌株的酸耐受限度由pH 3.4提高到pH 3.2。argG的过表达，改变了植物乳杆菌氨基酸代谢通路的代谢流，ADI通路和苹果酸代谢的代谢流显著增加，细胞内ATP含量和H+-ATPase酶活显著上升，胞内pH保持在一个较高的水平，从而有效增强植物乳杆菌的胁迫耐受性。伴侣蛋白hsp18合成，DNA损伤修复相关的基因uvrA、recN、recO、recA和recF的表达，柠檬酸代谢速度并没有因为argG的过表达而上调，它主要通过调节细胞内外H+稳定、提高H+-ATP酶活和提高ATP产量等方式提高酸胁迫耐受性。