皮质抑素抑制血管钙化的Wnt信号调控机制研究

vascular calcification resembling osteogenic mineralization is a pathologic foundation of a multifaceted vascular diseases and well-de?ned risk factor for cardiovascular disease and mortality. On the basis of our previous experimental results that cortistatin(CST) can attenuate vascular calcification in rats through growth hormone secretagogues receptor 1a(GHSR1a), we proposed the hypothesis that CST can inhibit vascular calcification in rat through regulating Wnt signal pathway including Wnt/β-catenin, Wnt/c-jun N-terminal kinase (JNK) and Wnt/ protein kinase C (PKC). Therefor, we will observe whether CST affects the key factors of Wnt signal pathway such as β-catenin、JNK and PKC in calcified aortic tissues of rat induced by vitamin D3 and warfarin, further explore how CST-inhibiting vascular calcification is mediated via three Wnt signal pathways and identify what role Wnt,Disheveled(Dvl),JNK and PKC as targets of Wnt signal pathway interfered by adenovirus-induced gene overexpression, small interfering RNA technique and blocking agent play in CST-mediated anticalcification in calcification model of vascular smooth muscle cells induced by inorganic phosphorus. These questions to be solved will contribute to find a new target for prevention and cure of vascular calcification and deeply reveal the molecule mechanism of inhibition of vascular calcification exerted by CST, providing substantial experimental data for clinical treatment of vascular calcification with CST.

血管钙化类似于成骨矿化过程，是多种血管疾病的病理基础，成为心血管疾病及死亡的危险因子之一。申请者在前期研究证实皮质抑素（CST）能够激活GHSR1a受体抑制大鼠血管钙化的基础上提出CST通过Wnt/β-catenin、Wnt/ JNK和Wnt/ PKC等Wnt信号通路的三条途径抑制血管钙化的发生发展。为此，拟在维生素D3联合华法林所致的大鼠血管钙化模型中研究CST对Wnt信号通路关键分子β-catenin、JNK和 PKC的影响，进而在无机磷诱导的大鼠血管平滑肌细胞钙化模型中阐明CST抗钙化是由调控Wnt信号的三条途径实现的，并以Wnt、Dvl、JNK和PKC为作用靶点，应用腺病毒介导的基因过表达、小RNA干扰和阻断剂等方法明确Wnt信号通路在CST抗钙化中的调控机理，深入揭示CST抗钙化的分子机制，有助于发现血管钙化防治的新靶点，并为CST应用于临床血管钙化的防治提供更充分的实验资料。

血管钙化与衰老、高血压、动脉硬化和慢性肾衰的疾病过程密切相关，能够增加心血管事件的发生率和死亡率。我们前期结果证实CST能够激活GHSR1a抑制大鼠血管钙化过程，但是CST与血管钙化的关系及具体分子机制远未阐明。因此，我们利用维生素D3所致大鼠体内钙化模型和β-甘油磷酸所致的大鼠血管平滑肌细胞（VSMCs）体外钙化模型验证CST是否能够抑制动脉钙化和VSMCs的成骨转化，并进一步探讨其可能的分子信号机制。钙化模型分别采用维生素D3诱导的快速钙化体内模型和β-甘油磷酸孵育所致的大鼠VMSC的体外钙化模型，钙含量，碱性磷酸酶活性（ALP）和钙沉积染色分别采用邻甲酚酞络合酮比色法、磷酸苯二钠法、茜素红和von Kossa 染色法检测，组织和细胞的蛋白表达采用western-bloting方法检测。结果发现给予CST能够显著抑制维生素D3所致的大鼠主动脉钙含量增加和病理性损伤，逆转钙化时VSMCs向骨表型转换，同时降低主动脉组织中β-catenin的蛋白表达水平。而且不同剂量的CST能够降低β-甘油磷酸诱导的VSMCs矿化和成骨表型转化过程，表现为降低ALP活性和钙含量，减轻钙化时的VSMCs形态学改变以及升高SMα-actin的蛋白表达量而降低OCN的蛋白表达。同时，CST能够增加钙化VSMCs中的GSK3β活性，进一步减少β-catenin蛋白表达，而这一效应能够被GSK3β活性抑制剂LiCL逆转，表现为增加VSMCs的ALP活性、钙含量和β-catenin蛋白表达。而且，CST能够促进钙化VSMCs中p-PKC而不是p-JNK蛋白的表达从而抑制钙沉积和向成骨表型转化过程，而应PKC抑制剂Go6976预处理VSMCs后能够拮抗CST抗钙化作用。这些数据表明CST能够抑制主动脉钙化过程和平滑肌细胞向成骨表型转化，而且进一步证实CST的抗钙化效应由Wnt/β-catenin信号通路和Wnt/PKC信号通路介导的，而可能与Wnt/JNK 信号通路无关，从而有助于揭示血管钙化的发病机制，也为CST防治血管钙化的临床转化提供强有力的理论基础和实验证据。