斑马鱼前折叠素3抑制Wnt/β-catenin 信号通路调控胚胎发育的机制研究

Molecular chaperones are abundant, well-conserved proteins and play very important role in promoting efficient folding and preventing aggregation of proteins. The Dysfunction of molecular chaperones is associated with many pathphysiological processes such as abnormal fertilization, developmental defect, and aging. However, it is not clear that the functions of prefoldin, a chaperone, in early embyonic vertebrate development. Recently our research showed that overexpression of PFD3 in zebrafish embryo resulted in severe developmental defect and inhibited Wnt/β-catenin signaling pathway. These results indicated that PFD3 may play a vital role in early embryonic development via interaction with Wnt/β-catenin signaling pathway. In this proposal, we use zebrafish, an excellent model system in develoment research because of transparent embryos and in vitro development, to explore the role of PFD3. Combining gene overexpression, loss of function and gain of function, Cas9 gene editing with cell cuture in vitro, we will investigate the function of PFD3 in early development and how it interact with Wnt/β-catenin pathway. This study will uncover the mechanism how Wnt/β-catenin is regulated in vivo by PFD3, and ultimately provide the data for the zebrafish as a model organism in investing the functions of PFD family.

分子伴侣是广泛存在于生物体内对蛋白质折叠、组装及降解起调控作用的重要分子，介导了生长发育、衰老等生理病理过程。前折叠素（PFD）作为一种分子伴侣是否调控脊椎动物生理功能目前尚不清楚，研究其早期生长发育中的功能至关重要。我们的前期研究发现模式动物斑马鱼PFD3过量表达导致了严重的发育缺陷，而且这种缺陷是通过影响早期发育的重要信号通路-经典Wnt信号通路实现的，提示PFD3可能作为重要的胚胎发育调控分子，参与了脊椎动物的早期发育。本项目拟以斑马鱼为模式动物，利用其胚胎透明、体外发育的特点，通过体内过表达、敲降和营救、cas9基因突变等方法，结合体外实验，探讨PFD3体内功能并从分子水平上分析其与Wnt/β-catenin信号通路的关键交联分子及作用机制，分析PFD功能的保守性。研究结果将全面揭示PFD3在动物早期胚胎发育中的地位作用，最终为斑马鱼作为研究前折叠素家族功能的模式生物提供依据。

通过在模式动物斑马鱼及体外培养细胞系中的研究较为系统、深入地阐述了VBP1调控TCF蛋白稳定性和Wnt信号通路活性的机制。研究发现斑马鱼 vbp1 基因敲除纯合突变体致死，且在 TopGFP 报告斑马鱼中敲除或敲降 Vbp1 均能抑制 Wnt 信号通路。比较意外的是，本文研究发现在斑马鱼胚胎中过表达 VBP1 同样能够抑制 Wnt 信号通路。另外，在体外细胞系中的研究同样表明过表达或敲降 VBP1 均能抑制Wnt信号通路。更深入的机制研究发现，VBP1 能够在 TCF 转录水平调控Wnt信号通路，且敲降或过表达VBP1均导致 TCF 蛋白稳定性降低。然而在 VHL 功能缺陷的 786-O 细胞中VBP1 失去对TCF蛋白稳定性的调节作用，表明VBP1促进TCF的蛋白降解依赖VHL的功能。进一步对其机制进行研究，免疫共沉淀及 GST Pull down 实验表明无论在体内或是体外VBP1 能与 TCF 相互结合形成复合体。而且 TCF 删除核定位信号后依然能在细胞质中与VBP1 相互结合，但是当结合发生在细胞质中时VBP1不能促进TCF 的蛋白降解，表明VBP1在细胞核内发挥功能促进 TCF 的蛋白降解。VBP1 的氨基末端及羧基末端均能与 TCF 及 VHL 相互结合且都具有抑制 Wnt 信号通路的功能。最后，本文研究发现 VBP1 可能通过作用于TCF 的 HMG DNA 结合结构域来调节 TCF 蛋白稳定性并调控 Wnt 信号通路。