植物新型碱基编辑技术的建立

Base editing is a newer genome-editing approach that has been optimized and wildly utilized in different fields of biology. There are two classes of base editor: cytosine base editors (CBEs) and adenine base editors (ABEs). So far, the editor with combined function of CBEs and ABEs has not been developed. Moreover, only a few studies focused on diversifying editing and screening for gain-of-function variants using base editors. In this project, we plan to combine CBEs and ABEs and develop novel base editors: cytosine and adenine base editors (CABEs). CABEs can be used to edit cytosine and adenine simultaneously in the plant genome, resulting diversifying editing in the target region. We also plan to generate a mutant pool covered the OsACCase functional domain using CABEs and then screen the herbicide resistance mutations. Utilization of CABE to screen the herbicide resistance mutations will be a model for investigating and improving other proteins in plants. CABEs will be powerful new tools that enable efficient exploration of elite traits and fast breeding.

碱基编辑技术自从被开发以来得到了迅速发展，已被广泛应用在了各个研究领域。碱基编辑技术主要包括胞嘧啶碱基编辑(CBE)和腺嘌呤碱基编辑(ABE)两套系统，但将CBE和ABE结合使用的编辑工具还鲜有报道，另外利用碱基编辑技术发掘功能获得性突变的研究也相对较少。本项目试图将CBE和ABE技术有机结合，开发出同时能够对胞嘧啶和腺嘌呤进行编辑的“胞嘧啶腺嘌呤碱基编辑(Cytosine and Adenine Base Editor, CABE)”技术体系。新型的CABE体系能够对植物內源基因的胞嘧啶C和腺嘌呤A同时进行高效的碱基编辑，从而实现多样化的核苷酸突变。本项目试图通过使用CABE直接对水稻內源基因OsACCase关键功能域进行大量突变并筛选具有除草剂抗性的突变体，这对植物其它基因功能获得性突变的发掘具有借鉴意义，对农作物优良性状的挖掘开发、对加速现代育种进程具有重要推动作用。

碱基编辑技术自从被开发以来得到了迅速发展，已被广泛应用在了各个研究领域。碱基编辑技术主要包括胞嘧啶碱基编辑(CBE)和腺嘌呤碱基编辑(ABE)两套系统，但将CBE和ABE结合使用的编辑工具还鲜有报道，另外利用碱基编辑技术发掘功能获得性突变的研究也相对较少。本项目将CBE和ABE技术有机结合，开发出同时能够对胞嘧啶和腺嘌呤进行编辑的新型“饱和靶向内源基因突变碱基编辑器(saturated targeted endogenous mutagenesis editor, STEME)”。新型的STEME系统能够对植物内源基因的胞嘧啶C和腺嘌呤A同时进行高效的碱基编辑，从而实现多样化的核苷酸突变。通过对STEME系统的关键元件进行优化，进一步提高了该编辑系统的编辑效率和编辑范围。本项目利用STEME系统对水稻的乙酰辅酶A羧化酶的羧基转移酶结构域进行饱和突变获得了水稻突变体库，随后对突变体库进行除草剂筛选，共发现四个除草剂抗性突变位点：P1927F、W2125C、S1866F和A1884P。除W2125C以外，其余三个抗性位点未曾在植物中有过报道。其中，P1927F与W2125C突变一样表现出强除草剂抗性，具有较高的生产应用潜能。基于同源蛋白结构模型分析发现，这些氨基酸突变直接或间接地影响了除草剂结合口袋的构象，从而降低了其对除草剂分子的结合能力而获得除草剂抗性。.STEME技术体系的建立，对于原位定向进化植物的内源功能基因提供了新型技术支撑，对农作物分子设计育种具有重要意义。此外，STEME系统还有望应用于不同细胞系、酵母或动物中的非编码区的顺式作用元件的调控、动物致病SNV的修正和抗药位点的筛选等。研究获得的抗除草剂优异种质资源有助于推进基因组编辑耐除草剂水稻在生产中的应用。