基于CRISPR/Cas系统的新型植物基因组编辑技术研究

Genome editing is a recently developed technique that can generate mutants in target DNA sequences.Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) systems provide bacteria and archaea with adaptive immunity against viruses and plasmids by using CRISPR RNAs (crRNAs),in combination with Cas9 nucleases, to guide the silencing of invading nucleic acids.This approach is to exploit the type II CRISPR/Cas system in Streptococcus pyogenes to cause mutagenesis in plant genome. By expressing Cas9 and crRNA,tracrRNA either respectively or in chimera, we will elucidate:1.The precision,efficiency and mechanism of mutagenesis caused by the system; 2.By modifying the two nuclease domains, Cas9 can also be converted into a nicking enzyme to facilitate homology-directed repair with minimal mutagenic activity.The objective of this research will establish a novel system for RNA-programmable genome editing in plant featured with simple customer design, precision and high efficiency.

基因组编辑技术是近年来发展起来的一种针对特定DNA序列进行定点突变的方法。细菌中的分子免疫机制-clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated(Cas)系统通过小RNA识别入侵的DNA（如噬菌体、质粒），并与核酸酶Cas蛋白形成复合体而沉默异源DNA。本研究利用化脓链球菌的II类CRISPR/Cas系统研究在植物基因组中产生定点突变的可能性，通过构建在植物中表达crRNA、tracrRNA二种单链RNA和二者串联的融合RNA，并与Cas9蛋白同时表达以研究：1.该系统引起靶基因突变的精确性、效率及其产生的机制；2.通过表达只切割单链DNA的Cas9，探讨利用该系统进行DNA精确突变的可能性；通过研究，建立一种简单、精确和高效的新型植物基因组编辑技术体系。

本研究利用化脓链球菌的II类Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)/CRISPR-associated(Cas)系统，研究在植物基因组中产生基因(或DNA)精确定点整合入染色体(gene knock-in)。同时尝试利用指导RNA偶联核酸内切酶进行基因组定点突变的可能性。以研究：1.利用CRISPR/Cas9系统中的Cas9突变产生的DNA缺刻酶（nickase），在多组引导RNA的介导下，在外源DNA二端精确切割，产生与基因组特定位点二端完全同源的序列，通过同源重组将外源基因或DNA整合入染色体的特定位点，即产生基因敲入(gene knock-in)；2.利用指导RNA偶联核酸内切酶(guided RNA and tethered endonuclease, GRATEN)进行基因组定点突变，研究利用GRATEN系统在植物中产生突变的精确性、效率及其产生的机制。通过研究，建立可广泛使用的、简单、特异和高效的新型植物基因组编辑技术体系。