CRISPR/Cas基因组编辑和碱基编辑技术在玉米中的高通量应用研究

High-throughput applications of CRISPR/Cas tools in maize are important to release the potentials of the CRISPR/Cas technology in maize. We will develop a high-throughput platform for genome editing and base editing by integrating two sets of maize transformation-enhancing systems and a variety of CRISPR/Cas tools. The two transformation-enhancing systems include the one based on maize Bbm and Wus2 genes, which stimulate transformation, and the other based on Agrobacterium ternary vectors. The genome editing tools include CRISPR/Cas9, CRISPR/Cpf1, gene disruption, gene activation, epigenome editing, and combinations of the tools. The base editing tools include two types of editors (C-T editor and A-G editor), and a few Cas9 orthologs or variants recognizing different PAMs, such as SpCas9, xCas9(3.7), SaCas9, and KKH-SaCas9. We will also construct maize CRISPR libraries using the high-throughput platform and make efforts to screen for mutant lines with traits of interest. We anticipate that the high-throughput platform will facilitate maize functional genomics and molecular breeding in a better way.

实现CRISPR/Cas技术在玉米中的高通量应用，对于充分发挥该技术在玉米中的应用潜力意义重大。本项目拟通过整合两套玉米转化增强系统和各种CRISPR/Cas工具建立高通量的玉米基因组编辑和碱基编辑技术平台。拟整合的两套玉米转化增强系统包括：基于玉米Bbm和Wus2基因促进转化的系统，以及基于农杆菌三元载体策略增强转化的系统。拟整合的基因组编辑模块包括CRISPR/Cas9、CRISPR/Cpf1、基因失活、基因激活、表观遗传学工具及各种工具模块的组合。拟整合的碱基编辑模块包括C-T编辑器、A-G编辑器、SpCas9及变体xCas9(3.7)、SaCas9及变体KKH-SaCas9等。我们还将使用建立的高通量技术平台尝试构建CRISPR突变体库，筛选具有目标性状的突变体。项目拟建立的玉米高通量CRISPR/Cas技术平台，可以更好地为玉米功能基因组研究和分子育种服务。

缺乏合适的递送方法阻碍了CRISPR/Cas在很多植物中的高效应用。整合形态建成调控基因(MR)和三元载体系统有望解决这个问题。为此，我们首先构建了四种MR模块，测试结果证实MR模块大大增强了玉米转化。接着我们测试了MR模块和CRISPR/Cas9模块的兼容性，测试结果表明二者的功能活性不会相互干扰。最后，我们开发了一种新型三元载体系统用于整合MR和CRISPR/Cas模块。我们的三元载体由pGreen3新型双元载体和农杆菌致毒辅助载体pVS1-VIR2组成。新型pGreen3双元载体衍生于RK2质粒，在兼容性和稳定性上优于衍生于pSa农杆菌复制系统的pGreen载体。致毒辅助载体pVS1-VIR2衍生于农杆菌pVS1质粒，携带17-kb的致毒基因簇，后者来自农杆菌EHA105的Ti质粒。致毒辅助载体还携带来自RK2质粒的三个片段，为pGreen3在农杆菌中的复制和稳定性提供必要的蛋白。测试结果表明我们的三元载体系统和MR模块对于增强玉米转化具有加和效应，且这种增强作用对于难转化玉米自交系效果尤其明显。总之，我们开发的新型三元载体系统为在玉米中高效递送CRISPR/Cas提供了一种用户友好型的解决方案，同时也为其他难转化植物提供了一种基础性的平台。.引导编辑技术是2019年出现的、一种全新的衍生于CRISPR/Cas系统的精准基因组编辑技术，在通用性和精准性上大大优于碱基编辑技术。因此，我们放弃了碱基编辑技术的研发，转而聚焦于引导编辑技术的应用和优化。我们在pGreen3三元载体系统上构建了引导编辑器并成功获得了可遗传的玉米引导编辑突变体株系。为克服引导编辑效率偏低的问题，我们对引导编辑技术进行了优化。优化后的引导编辑器可以在水稻和玉米中高效诱导精准基因组突变。为了测试引导编辑在蛋白定向进化中的应用，我们针对水稻ALS的W548和S627位点以及ACC的I1879位点构建了引导编辑器文库。测试结果表明，引导编辑器可以实现特定位点的饱和氨基酸突变。总之，我们基于引导编辑技术和pGreen3三元载体系统在玉米中实现了精准基因组编辑和高效递送工具的整合，成功搭建了玉米精准基因组编辑技术平台。