抗泛素修饰长效Survivin显性负突变体的构建表达及其肿瘤细胞杀伤作用研究

肿瘤组织中Survivin的高表达可促进肿瘤细胞和肿瘤血管内皮细胞的增殖和抗凋亡能力。以Survivin为靶点的治疗策略通过抑制其表达或破坏其功能而诱发肿瘤细胞凋亡已经成为共识。我们的前期研究已经证明Survivin多点氨基酸替代突变体可以明显提高显性负突变体促肿瘤细胞凋亡的活性，然而与野生型分子相比，突变体分子通过泛素化修饰途径降解的速度明显加快，这将影响抑制体内肿瘤生长的效果。因此，我们提出利用抗泛素修饰Survivin显性负突变体弥补先前研究中的不足，采用基因重组技术获得抗泛素修饰的显性负突变体基因，使用病毒或原核蛋白生产系统表达这些重组分子，利用泛素修饰实验和蛋白质半衰期检测实验观察这些分子是否具有较长的半衰期，通过体内抑瘤实验观察抗泛素修饰的分子是否具有持久强效的凋亡诱导活性。这将为以Survivin为靶点肿瘤治疗手段提供新的策略并具有重要的应用前景。

在本申请基金的资助下，我课题组围绕促肿瘤增殖和抗凋亡的IAP家族分子Survivin的降解通路进行了研究，并希望从中发现触发Survivin降解的泛素化修饰位点，进而建立更有效的Survivin显性负突变策略，为肿瘤生物治疗奠定实验基础。我们顺利完成了第一年的年度计划，将所有Survivin赖氨酸（K）位点突变为丙氨酸（A），但是在第二年确认哪些K位点可能是受泛素分子（Ubiquitin）修饰的研究中，去没有发现不同K位点对Ubiquitin修饰存在差别。因此，我们在第二年的计划修改中，也申请就Survivin降解研究的方向从研究Survivin分子的蛋白质降解改为研究Survivin分子的转录后基因表达调节，即microRNA介导Survivin的负向表达调控。我们在喉癌细胞中发现：miR-203分子可以通过靶向降解survivin分子的mRNA，进而抑制肿瘤细胞的增殖能力，针对survivin分子的功能缺失及恢复实验进一步明确了两者之间的功能联系。同时，我们在喉癌样品中也确认miR-203与survivin的表达呈现反相关关系，这对解释miR203分子的抑癌功能和survivin分子在肿瘤细胞中的高表达提供了重要的理论证据。在对结肠癌中survivin表达调节的研究中，我们发现miR-320可以通过靶向抑制经典Wnt信号通路的关键共转录分子β-catenin下调survivin的表达，而在新鲜结肠癌标本的分析也确认miR-320与survivin的表达呈现反相关关系。为了更加系统和全面地分析miRNA分子对survivin的转录后基因沉默机制，我们克隆了survivin分子3’UTR全长2081bp的DNA片段，现在正在利用自行构建的包含350个miRNA前体分子的质粒系统进行报告基因筛查实验，进一步全面分析调控survivin的miRNA分子及其与肿瘤进程之间的关系。此外，在进行survivin显性负突变的研究过程中，我们利用成熟的蛋白质表达纯化平台也获得了一个N端融合TAT膜转位肽的FHIT抑癌融合蛋白，并在肝癌细胞中证明其可以通过线粒体途径诱导肿瘤细胞凋亡，提示其可能作为有效的肿瘤凋亡诱导分子。