转录调控子DisR调控细菌生物被膜形成的分子机制

Biofilm is a way of life for microorganisms to overcome diverse adverse environment. Biofilm control is important in basic theoretical research and bioengineering applications. Bacterial biofilm was commonly regulated by the intracellular cyclic diguanylate (c-di-GMP). However, although the mechanism is unclear, biofilm formation of sulfate-reducing bacteria (SRB), used in wastewater treatment, is not affected by c-di-GMP. Previously, the applicant has found that the SRB regulator DisR significantly inhibits its biofilm without any known signal receiving domain. To elucidate the novel mechanism of SRB biofilm formation and regulation, in this project, we will investigate the upstream biofilm regulatory signals of DisR through high-throughput screening under different conditions, and identify the DNA binding sequence and the target genes of DisR regulatory by RNA-seq and Chip-seq. Furthermore, we will analyze the how the regulated genes affect the biofilm formation and the extracellular polymer composition. This study will enrich the understanding of bacterial biofilm, and provide theoretical basis for SRB application on wastewater treatment.

生物被膜是微生物抵御外界不良环境的生活方式，控制生物被膜在基础理论研究和生物工程应用方面均具有重要意义。细菌生物被膜的形成主要受体内环二鸟苷酸的调控。然而研究表明，应用于污水处理的硫酸盐还原细菌（SRB）生物被膜的形成调控不依赖于环二鸟苷酸但具体机制不明。申请人前期发现SRB调控因子DisR能显著抑制自身生物被膜形成，且无已知信号分子感受功能域。为进一步阐明DisR调控生物被膜形成这一新型机制，本项目拟通过高通量筛选分析不同环境信号下，DisR对生物被膜的影响，确定其上游调控信号。在最适信号条件下，利用转录组测序及染色质免疫沉淀测序等技术鉴定DisR结合DNA区及对应靶标基因，并对关键基因进行生物被膜形成、胞外多聚物组成等方面功能性研究，最终从分子水平上阐明SRB的生物被膜调控机制。在丰富人们对生物被膜认识的同时，也为克服SRB污水处理的技术瓶颈，开发高效微生物净水剂提供理论依据。

生物被膜是微生物抵御外界不良环境的生活方式，控制生物被膜在基础理论研究和生物工程应用方面均具有重要意义。然而研究表明，在重金属污水处理及金属锈蚀防控领域极具应用前景的硫酸盐还原细菌（SRB）的生物被膜形成及调控不依赖于现有的调控机理，且具体机制不明。本项目前期发现SRB调控因子DisR能显著抑制自身生物被膜形成，且无已知信号分子感受功能域，在此基础上围绕DisR上游信号物质和下游调控靶标开展研究工作：1）分析筛选了包括氨基酸、群体感应信号分子及抑制剂、小分子有机酸、糖和天然产物衍生物在内的近百种信号对DvH菌株生物被膜形成的影响，并从中发现葡萄糖、酪氨酸、苯甲酰胺衍生物22#均有不同程度的显著抑制或增强作用；2）结合前期工作基础，通过筛选评价，选取了葡萄糖处理作为影响生物被膜形成的方式，验证了DisR调控子编码基因在生物被膜形成改变时的转录变化；3）构建了融合DisR调控子基因启动子的荧光蛋白基因表达载体及重组菌，有利于于后续DisR激活的观察研究。4）利用葡萄糖作为处理条件，通过比较转录组学分析，发现该条件下，质粒pDV起到主要响应作用；5）通过不断优化DisR的异源表达纯化条件，获得了质量较高的蛋白，并基于此完成了其结合的下游靶标序列分析和验证，发现了DisR直接正向和负向调控的8个靶标基因；6）综述了近年来SRB生物被膜的形成与调控研究，并针对了DvH菌株基因组中的3个潜在的群体感应信号分子受体蛋白基因开展了生物信息学分析；7）通过构建生物被膜时期高表达基因重组菌和基因敲除突变株，验证了部分靶标基因在生物被膜形成过程中的作用，尤其是发现一个小肽蛋白DVU0086能接近100%抑制SRB生物被膜形成。本项目以首次发现的SRB生物被膜调控子DisR为突破点，鉴定了影响SRB生物被膜形成的外界信号物质和DisR下游调控相关靶标基因，为揭示一种全新的细菌生物被膜调控机制奠定理论基础。在丰富人们对生物被膜认识的同时，也为克服SRB污水处理的技术瓶颈，开发高效微生物净水剂提供理论依据。