坦布苏病毒囊膜E蛋白关键位点介导病毒穿越鸭血脑屏障的分子机制研究

The Duck Tembusu virus (DTMUV) infection has spread across the China mainland since its outbreak in 2010, leading to great economic loss for the duck industry. Studies have shown that the DTMUV can cause serious damage to the central nervous system after infection of ducklings. However, the mechanism is not yet clear. In previous study, we have found the pathogenicity of DTMUV is attenuated after passages in vitro, and the damage to nervous system decreased. The amino acid of the envelope E protein was mutated. The mechanism may be related to the ability of the mutation site to mediate the ability of the virus to cross the blood-brain barrier of ducks. Therefore, this project intends to construct the mutant strains of key amino acids in DTMUV envelope protein E to explore its reproduction in the central nervous system of ducklings. The blood-brain barrier (BBB) model in vitro will be constructed to study the role of mutant strains to the BBB permeability and related tight junction protein, which could reveal the molecular mechanism between virus and the vascular endothelial cell/glial cells. The construction of ducklings model by mutant strains infection is beneficial to understand the mechanism of capsule membrane protein key site mediated virus cross the BBB, preliminary clarifying the mechanism of DTMUV invasion to the nervous system. The project will provide theoretical basis for the prevention and control of DTMUV infection, and pave the way for further study on the invasion mechanism of other avian encephalitis virus.

2010年4月鸭坦布苏病毒感染在我国首次爆发，该病传播速度快，发病范围广，给养鸭业造成了巨大的经济损失。研究显示DTMUV感染雏鸭引起中枢神经系统严重损伤，病毒进入中枢神经系统的途径及其机制目前尚不明确。本课题组前期研究发现体外传代致弱DTMUV的基因组中囊膜E蛋白氨基酸发生突变，且对雏鸭神经损伤程度明显降低，其机制可能与突变位点介导的病毒穿越鸭血脑屏障能力相关。因此，本项目拟构建DTMUV囊膜E蛋白关键位点定向突变株，研究其在雏鸭中枢神经系统的增殖情况；建立雏鸭血脑体外屏障模型，研究突变株感染引起血脑屏障通透性及相关紧密连接蛋白的变化情况，揭示病毒与血管内皮细胞和神经胶质细胞作用的分子机制，并通过感染雏鸭实验进一步验证，探讨囊膜E蛋白关键位点介导病毒穿越血-脑屏障的机制，该项目将为DTMUV感染的防治提供理论依据，并为深入探讨其他禽类脑炎病毒的入侵机制提供重要借鉴。

鸭坦布苏病毒感染雏鸭可引起中枢神经系统严重损伤，而病毒进入中枢神经系统途径及其机制尚不明确。本课题以鸭坦布苏病毒JXSP 2-4（野毒株）为基础，在扩增引物中引入突变位点，利用Overlap-PCR方法获得突变基因，构建鸭坦布苏病毒囊膜E蛋白关键位定向突变株。通过感染雏鸭及BHK-21细胞实验发现，病毒E蛋白K367突变可明显降低病毒增殖能力及致病性。利用小鼠脑血管内皮细胞（bEnd3.1）成功建立体外血脑屏障模型，其跨内皮阻抗值稳定维持在150 Ωcm2以上。JXSP 2-4株感染bEnd3.1细胞6h后可明显降低细胞跨内皮阻抗值，同时可检测到穿透bEnd3.1细胞的病毒，而JXSP K367株感染bEnd3.1细胞后未发现其跨内皮阻抗值改变且未发现病毒透过bEnd3.1细胞。同时JXSP 2-4株可降低bEnd3.1细胞中紧密连接相关蛋白（ZO-1、claudin-1、occludin）表达，提高单核细胞相关趋化因子（CCL2、CCL8、CCL12及MIP-1γ）表达，病毒E蛋白 K367突变可明显改变病毒透过血脑屏障能力，可能与其影响病毒致血脑屏障紧密连接相关蛋白（ZO-1、claudin-1、occludin）和单核细胞相关趋化因子（CCL2、CCL8、CCL12及MIP-1γ）表达改变相关。利用雏鸭感染实验，分离鸭脑毛细血管检测紧密连接相关蛋白及趋化因子表达显示，JXSP-K367株感染组较JXSP 2-4株感染组并未明显改变鸭脑紧密连接相关蛋白及趋化因子表达水平，提示鸭坦布苏病毒E蛋白 367位点可能是病毒跨越血脑屏障的关键位点之一，其突变降低了病毒对血脑屏障的结构和功能损伤从而减弱其穿越血脑屏障的能力。本课题初步明确鸭坦布苏病毒可能通过改变血脑屏障通透性及上调血脑屏障单核细胞趋化能力，引起粘附病毒的单核细胞穿越血脑屏障，使病毒侵入中枢神经系统。鸭坦布苏病毒E蛋白K367突变可降低病毒穿越血脑屏障能力，从而降低神经中枢系统病毒滴度及其致病性。本课题为鸭坦布苏病毒感染的防治提供理论依据，进一步丰富了禽类脑炎病毒的入侵机制研究。