鸭坦布苏病毒E蛋白毒力相关位点的研究

Duck Tembusu virus (DTMUV) is an emerging agent causing paralysis and a severe drop in egg production in egg-laying ducks. The disease has caused a serious economic loss since 2010.The virions are an enveloped positive-stranded RNA virus with a size of approximately 45 nm in diameter. The virus genome consists of a single-stranded, positive-sense RNA of 10 990bp, with a single open reading frame (ORF) that encodes a large polyprotein. This is the first report that a zoonotic flavivirus caused severe duck disease. The Virulence determinants and pathogenicity mechanism of DTMUV remain unknown. The Flavivirus major envelope glycoprotein (E) is also the putative cell receptor binding protein and mediator of membrane fusion and cell entry and appears to be an important determinant of neurovirulence and neuroinvasiveness in animal models. So we carry out a study of virulence determinants of DTMUV in advance. This will further lay the foundation for research DTMUV molecular pathogenesis. However, whether can we as soon as possible to carry out this study. The key is to establish a technology platform to manipulate the virus genome at the molecular level. The full-length infectious clone of the current epidemic strain of DTMUV will be constructed on the basis of the whole genome sequence of DTMUV ZJ-407 for further studies of DTMUV. The virulence determinants of the protein E are indentified by using reverse genetics techniques. These studies have important academic significance for futher study receptor, molecular pathogenicity and artificial attenuated vaccine of DTMUV.

鸭坦布苏病毒（TMUV）是一种新发现的能引起鸭产蛋下降的新型黄病毒。该病自发生以来已给我国养鸭业造成了巨大经济损失。该病毒为单股正链，有囊膜，直径为45nm左右的RNA病毒，是国际上首次发现能致鸭发病的虫媒黄病毒。目前，该病毒的毒力相关位点及分子致病机理等都不清楚，而黄病毒囊膜E蛋白是与细胞膜受体相结合介导病毒进入细胞的主要蛋白，且毒力位点大多数位于E蛋白上，为此我们预先开展DTMUV E蛋白毒力相关位点研究。而能否尽快开展DTMUV E蛋白毒力相关位点的研究，关键在于建立一个可以在分子水平上对病毒基因组进行操作的技术平台。为此我们拟在获得病毒全基因组序列基础上，构建其感染性克隆，然后在建立感染性克隆的基础上，利用反向遗传操作技术，系统研究DTMUV E蛋白相关毒力位点研究，研究结果将为进一步研究DTMUV受体、分子致病机制以及人工致弱疫苗等提供理论依据，因而具有重要学术意义。

本项目在国家自然科学基金（31302121）的资助下，按期完成了计划书规定的研究内容，实现了预期的工作目标。研究结果如下：(1)完成了DTMUV ZJ-6，407，YY5和 LH-2 4个分离毒株的全基因组测序（JF459991，JF270480, JQ314464, JQ314465）并对其基因组序列进行了系统的生物信息学分析；(2)对以上4个毒株不同代次的细胞毒E蛋白基因进行测序比对，发现E基因共有7个核苷酸位点发生变异，但只引起1个氨基酸位点发生变异。（3） 以DTMUV 407毒株为研究对象，通过In-fusion技术获得了含有DTMUV基因组全长的重组质粒pBac-T7-DMTUV。经测序比对验证，未发生核苷酸缺失，但有个别核苷酸发生变异；(4)通过体外转录全长线性化质粒，将转录RNA转染BHK-21细胞，经鉴定体外转录的RNA具有感染性；(5) 对拯救的DTMUV人工毒进行了TCID50测定、基因组复制动力和一步生长动力特性，及鸭/鸡胚致病性研究表明：拯救的人工毒与母本毒的生物学特性基本相似；（6）利用E蛋白15多肽库对筛选出E蛋白的一个B细胞线性抗原表位，其最小功能区域为385LVGSGKGQ393；（7）利用反向遗传学技术构建了3个突变体，通过拯救，并对拯救病毒的TCID50及胚体致病性进行测定。结果表明，突变糖基化位点（NYS→YYS）可显著降低DTMUV的毒力。在执行该研究项目期间，累计发表学术论文5篇，其中2篇SCI论文；申请国家发明专利2项。完成了计划书中的各项考核指标。