发作性运动源性手足舞蹈徐动症致病基因PRRT2突变体的突触传递功能研究

In 2012, the project applicant identified PRRT2 as the gene mutated in a subset of paroxysmal kinesigenic choreoathetosis (PKC) patients by next generation sequencing (NGS) using targeted capture array and high-throughput resequencing platform. Compared with the wild type PRRT2, the interaction between synaptosomal-associated protein, 25kDa (SNAP25) and mutant PRRT2 were attenuated. The scientific question of the present research is "How the mutant PRRT2 caused PKC by elevating neuronal excitability and unbalancing neurotransmitter release during synaptic transmission". In the present study, we first over-express or knock-down PRRT2. Then the mouse brain neurons morphologies, excitatory state and neurotransmitter levels were tested and compared. We next construct conditional knock-down and major mutant knock-in mouse models to explicit the PKC phenotype and pathology function of mouse mutant PRRT2 in synapse transmission. After that we construct PRRT2-fused expression plasmid to determine the proteins interacted with PRRT2. Finally the protein interaction differences between mutant PRRT2 proteins are also tested to explicit the influence to synapse. The aim of the present study is to reveal the molecular mechanisms of how PRRT2 mutation caused PKC, so as to provide molecular targets for design drugs treating movement disorder related diseases.

2012年申请人利用新一代测序技术，成功发现了发作性运动源性舞蹈手足徐动症 PKC 的致病基因PRRT2及其突变，之后初步证实与野生型PRRT2相比，错义突变体与突触体相关蛋白SNAP25之间相互作用存在减弱趋势。本项目的科学问题是"PRRT2突变体在突触传递过程中如何导致神经递质释放失调从而使神经元兴奋性异常增高引发PKC发作"。拟应用过表达、RNA干扰PRRT2表达技术揭示小鼠脑部神经元形态及其兴奋状态、神经递质水平改变，构建PRRT2条件性敲除及主要突变体敲入小鼠模型以明确PKC表型及小鼠病理状态下PRRT2突变体对突触功能的影响，通过构建PRRT2融合蛋白表达载体鉴定与PRRT2相互作用的蛋白、比较不同PRRT2突变体与蛋白之间相互作用的差异，以及差异对突触功能的影响。本研究旨在揭示PRRT2导致PKC发生的分子机制，为设计特异有效的治疗运动障碍相关疾病的药物提供更多分子靶标。

2012年本项目组发现了富含脯氨酸跨膜蛋白2基因（proline-rich transmembrane protein 2, PRRT2）是发作性运动源性舞蹈手足徐动症（Paroxysmal Kinesigenic Choreoathetosis, PKC, OMIM 128200）的致病基因，随后开展了PRRT2突变体的功能研究。科学问题是“PRRT2突变体如何导致突触传递失调从而使神经元兴奋性异常增高引发PKC发作"，获得以下研究成果。..1．应用HPLC方法发现PKC病人血清中谷氨酸的含量明显高于正常对照组；小鼠皮层神经元功能缺失实验表明干扰组培养基中谷氨酸的含量明显高于对照组。提示PRRT2可能在调节谷氨酸的释放中发挥抑制作用。..2．通过Co-IP证实PRRT2与AMPAR受体的GRIA1之间存在相互作用，此相互作用在错义突变和截短突变后减弱甚至消失。PRRT2错义突变后丧失膜定位弥散在胞质，并且使GRIA1在膜表面的分布增加。提示PRRT2影响谷氨酸受体的表达与分布。..3. 应用基因敲除技术CRISPR/Cas9获得Prrt2基因3种截短突变大鼠模型；HE染色和尼氏染色观察未发现Prrt2+/+大鼠和Prrt2-/-大鼠在大脑皮层、小脑、海马中组织细胞存在异常。..4．PRRT2特异性表达于大鼠神经元。利用Western blot方法研究PRRT2的时间-空间表达谱，发现Prrt2+/-大鼠中存在单倍剂量不足效应。..5．与Prrt2+/+大鼠相比，Prrt2-/-大鼠在反映运动协调能力的平衡木以及衣架实验中存在明显差异，说明模型大鼠的运动协调能力明显受损。戊四唑（pentylenetetrazol, PTZ）诱导癫痫样发作实验表明，与Prrt2+/+相比，Prrt2-/-大鼠发生五级大发作的比例更大，发作时长更长，对PTZ的耐受性显著降低。..本研究首先成功构建Prrt2基因截短突变大鼠模型，并利用该模型深入探究PRRT2生理功能和PKC发病机制。研究结果表明，PRRT2是调节谷氨酸神经递质精确转运的关键分子之一，其截短突变体使兴奋性与抑制性系统平衡紊乱，引起机体相对兴奋性增高，造成PKC发病。