miR-375在胚胎干细胞向胰岛细胞分化过程中的调控作用及分子机制研究

miRNA是调控胚胎干细胞（ESC）分化的关键分子。miR-375是胰腺特异性miRNA，在胚胎胰岛发育过程中具有重要作用。但在ESC分化为胰岛细胞过程中，miR-375是否发挥调控作用尚不明确。.在前期工作中，我们通过芯片、实时定量PCR检测发现miR-375在ESC向胰岛细胞分化过程中呈阶段性差异表达，进一步结合生物信息学分析miR-375的靶基因，发现其中包含与胰腺分化相关的PAX6和HNF1β。本项目拟在此基础上：①通过增强和抑制miR-375表达，观察miR-375对ESC分化为胰岛细胞的影响，明确miR-375调控胰岛细胞分化的作用；②构建并转染含有PAX6和HNF1β序列的表达载体，通过miR-375与靶序列的结合实验确定miR-375调控胰岛细胞分化的作用靶点。研究成果将从一个新的视角揭示ESC分化为胰岛细胞的分子机制，有助于指导建立高效的体外诱导分化体系，提高分化效率。

目的：探讨microRNA（miRNA）在小鼠胚胎干（ES）细胞向胰岛素分泌细胞分化过程中的表达和变化趋势，明确特定miRNA在分化中的作用及其机制。.研究设计和方法：(1) 将小鼠ES细胞定向分化为胰岛素分泌细胞，应用高通量测序分析诱导分化不同阶段细胞miRNA表达谱的差异。(2) 应用实时定量PCR方法检测特定miRNA在ES细胞定向分化为胰岛素分泌细胞过程中的动态变化。(3) 应用Targetscan软件预测动态变化的miRNA的靶基因，同时应用实时定量PCR检测靶基因在分化过程中的动态表达。(4) 构建双荧光素酶报告基因载体，证实miRNA的靶基因。（5）构建miRNA过表达和敲除的慢病毒载体，进行细胞转染，分析相应的靶基因和分化阶段特异性标志物的基因和蛋白表达，并评价分化的胰岛素分泌细胞的功能变化情况。.结果：(1) 在前期工作中，我们通过miRNA芯片、实时定量PCR检测发现miR-375在ES细胞向胰岛细胞分化过程中呈阶段性差异表达，在诱导分化第6天，miR-375开始表达，至诱导分化9天时，miR-375表达水平略有增高，但变化不明显，在诱导分化第15天时，miR-375的表达水平明显增高。进一步结合生物信息学分析miR-375的靶基因，发现其中包含与胰腺分化相关的HNF1β。(3) 在ES细胞向胰岛素分泌细胞分化过程中检测HNF1β的表达，发现HNF1β在分化过程中的动态变化与miR-375的变化趋势呈反向关系。(4) 双荧光素酶报告基因载体分析结果证实HNF1β是miR-375的靶基因。过表达miR-375可抑制HNF1β蛋白表达，而miR-375敲除则可上调HNF1β蛋白表达。(5) 敲除miR-375可提高ES细胞向胰岛素分泌细胞分化的效率，促进胰岛素分泌细胞基因和蛋白的表达，并可促进高糖刺激下的胰岛素分泌反应。.结论：miR-375通过调控HNF1β在胰腺前体细胞向胰岛细胞分化过程中发挥重要调控作用，参与ES细胞向胰岛素分泌细胞的分化过程。.研究意义：从miRNA调控角度揭示ES细胞分化为胰岛素分泌细胞的分子机制，有助于指导建立高效的体外诱导分化体系，提高分化效率。