间充质细胞miR-4018a调控海鞘幼体变态的作用机制

Larval metamorphosis is an essential process involved in larval tissue regression and adult organ arise and formation for most of marine animals. However, the molecular mechanisms and signal pathways underlying larval metamorphosis remain largely unknown. MicroRNA is small RNA, which regulates multiple cellular processes via large number of target genes. Recently, we screened several miRNAs in Ciona savignyi through the compartion their expression level before and after metamorphosis. In situ further indentified one of miRNAs miR-4018a specifically expressed in larval mesenchyme and its predicted target genes involved in larval metamorphosis. Based on above results, this proposal aim to further study the interaction of miR-4018a and its target gene, and reveal its functions in Ciona larval metarmophosis by the double fluorescent reporter gene system and CRISPR/Cas9 knockout techniques. Achievements of this project will not only enrich the knowledge of molecular mechanisms of metamorphosis for marine animals, but also provide a foundation to develop efficient antifoulants for removing the attached animals in marine facilities.

海洋动物变态涉及幼体器官退化和成体器官发生，期间幼体细胞经历迁移和分化等细胞学过程，这些细胞学变化通过信号传导通路和基因网络调控。但至今调控幼体变态过程的分子机制知之甚少。MicroRNA是一类小分子非编码RNA, 通过降解靶基因mRNA或抑制其翻译调控众多生物学过程。申请人构建了海鞘变态前后的microRNA文库，筛选鉴定出miR-4018a特异性在间充质细胞中高表达，且变态后其表达量显著降低，暗示其参与海鞘幼体变态过程。本项目以海洋模式动物海鞘变态过程为模型，利用CRISPR/Cas9基因敲除等技术研究miR-4018a如何通过靶基因调控间充质细胞在幼体变态过程中的迁移分化，及通过外泌体途径调控其它组织器官发生。预期结果将丰富海洋动物附着变态调控机制的新认知，并有望为水产养殖苗种生产和海洋防污产品研发提供理论依据。

本研究以海洋模式动物萨氏海鞘（Ciona savignyi）为研究模型, 通过测序和表达分析筛选出一个间充质细胞miRNA簇（miR-4000f/4018a/4018b）和一个感觉囊泡内高表达的miR-4055，并对它们的功能分别进行了深入分析, 所得结果为理解海洋无脊椎动物器官发生的调控机理提供新认知。. 海鞘成体新器官由幼体的间充质细胞发育分化而来，我们发现miR-4000f/4018a/4018b簇表达的间充质细胞，在附着变态过程中逐渐向动物身体四周迁移至被囊，并在稚体发生过程中分化成tunic细胞。RNA-seq结果显示，和对照组相比，过表达miRNA簇的突变体动物的多个基因表达变化明显，结合靶基因的⽣物信息学预测结果，我们筛选到几个候选靶基因。荧光素酶报告基因结果表明miR-4018a/b具有共同的潜在靶基因lefty，而且在海鞘幼虫期lefty主要表达在间充质细胞中，上述结果初步揭⽰出miR-4018a/b 可能通过lefty 信号通路关键基因表达⽽调控海鞘幼体间充质细胞的迁移和分化，从而影响稚体tunic细胞生成和功能。. 海鞘幼体躯干部具有一个感觉囊泡，包含感觉重力的耳石和感觉光线的眼点，眼点的功能与脊椎动物眼睛同源。 通过显微注射miR-4055 antagomir 抑制miR-4055表达后，海鞘幼虫感觉囊泡内的眼点色素细胞消失，眼点感光细胞的增殖被抑制且排列异常，这些结果表明miR-4055在海鞘幼体眼点形成过程中发挥重要作用。进一步通过生物信息学分析和荧光素酶报告基因检测系统筛选并验证了akt 基因是miR-4055的靶基因； 过表达AKT或抑制AKT下游重要信号分子MAPK都能抑制眼点色素细胞色素的产生。同时，抑制AKT信号通路或过表达MAPK，都能营救miR-4055突变体中眼点色素细胞色素消失的表型。综上，miR-4055可以通过AKT-MAPK信号途径调控海鞘幼虫眼点色素细胞的色素生成，从而影响眼点的功能。