利用反式互补策略建立直观在体反映HCV RdRp酶活性的新型动物模型

基本信息
批准号:81171637
项目类别:面上项目
资助金额:78.00
负责人:尹文
学科分类:
依托单位:中国人民解放军第四军医大学
批准年份:2011
结题年份:2015
起止时间:2012-01-01 - 2015-12-31
项目状态: 已结题
项目参与者:雷迎峰,吕欣,杨敬,孙梦宁,黄小军,姚敏,王爽,兰海云,张建敏
关键词:
动物模型聚合酶丙型肝炎病毒抑制剂
结项摘要

HCV感染后慢性化率高达50~85%,无疫苗和特异治疗药物,严重危害人类健康。特别是由于缺乏合适的动物感染模型,严重限制了抗HCV药物的筛选与评价。本课题拟在前期研究基础上建立一种在体、直观和连续反映HCV RdRp酶活性的新型转基因动物模型,以方便用于RdRp酶抑制剂的筛选评价。为此首先要构建含有一系列调控元件的微基因组转录载体,受精卵显微注射后制备其转基因鼠首建鼠,筛选出RdRp酶介导下高复制微基因组正链RNA和高表达红色荧光蛋白的转基因鼠,进一步筛选出遗传性状稳定的纯合子转基因鼠。然后将纯合子转基因鼠与严格调控表达RdRp酶的三转基因小鼠(已获得)杂交,筛选出可严格调控表达红色荧光蛋白的四转基因小鼠,用在体成像技术评价该四转基因小鼠模型用作HCV抑制剂筛选的稳定性,并制定其标准,从而克服RdRp酶无直接底物,不易评价其酶活性的难题,为HCV药物评价提供切实可用的新型小动物模型。

项目摘要

HCV感染后慢性化率高达50~85%,进一步可发展为肝硬化和肝细胞癌,严重危害人类健康。特别是由于缺乏合适的动物感染模型,严重限制了抗HCV药物的筛选与评价。本课题建立了一种新型转基因动物模型,以方便用于HCV RdRp酶抑制剂的筛选评价。构建了表达HCV NS3-5B复制复合体的质粒,细胞转染荧光成像、Western Blot检测和荧光素酶(FLuc)活性检测都证实了表达的NS5B聚合酶的生物学活性。然后进行受精卵显微注射并制备首建鼠,鉴定阳性的首建鼠分别与C57小鼠交配以繁殖扩群,目前阳性转基因小鼠传代比较稳定,阳性率约为82%。Western Blot方法检测转基因小鼠组织NS5B蛋白的表达,结果正确,约为66KD。. 接着采用多重PCR法构建微小基因组pcDNA3.1(+)-(-)5UIRrG(-)3U重组质粒,酶切鉴定、测序结果经BLast分析显示,各目的片段基因序列与预期一致。在转染重组质粒的BHK-21细胞浆和细胞核中都可以观察到红色荧光。双质粒共转染细胞后荧光成像,结果显示可以观察到细胞同时表达绿色和红色荧光蛋白。而且,细胞培养液中和细胞中GLuc的活性大大高于对照组(P<0.05)。. 利用水动力转染法将微基因组载体转染到阳性转基因小鼠体内,基于GLuc蛋白的分泌性,分离血浆,加入发光底物腔肠素利用发光检测仪测发光值,结果发现在转染后36h左右测到最大发光值。转染微基因组质粒的小鼠通过腹腔注射GLuc发光底物腔肠素,结果显示当质粒注射剂量大于30ug时,GLuc表达不再随质粒注射量加大而升高。通过对30只成年转基因小鼠血清转氨酶检测和肝、肾、脾组织形态分析发现转基因小鼠与野生型C57小鼠相比,转氨酶和组织形态未发生明显改变。接着评价了微基因组质粒水动力转染的小鼠体内的HCV RdRp的活性,活体成像仪在体直观检测GLuc的表达,结果表明转基因小鼠组发光强度明显高于C57小鼠组,进一步在体证实HCV RdRp调控HCV微基因组质粒表达GLuc,达到了预期实验效果。从而克服了RdRp酶无直接底物,不易评价其酶活性的难题,为抗HCV药物的筛选评价提供了切实可用的新型小动物模型。发表文章13篇,其中SCI收录论文5篇,获得授权发明专利3项。

项目成果
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数据更新时间:2023-05-31

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