DNA甲基化在荷叶铁线蕨配子体性器官分化中的作用

近年来，人们发现植物性别分化除了受基因调控之外，还受到了DNA甲基化的调节。与种子植物相比，蕨类植物配子体结构简单、性器官分化表型明显易于观察，是研究植物性器官分化的理想材料。通过前期研究，发现适量、适时的外源钙可促进荷叶铁线蕨配子体雌性性器官的分化及颈卵器数量的增多。本项目拟在前期研究的基础上，采用荷叶铁线蕨同源配子体为材料，从表观和微观形态学水平比较和分析外源钙在配子体性器官形成中的可能作用。在基因水平上，运用HPLC、MSAP等技术，分析经（未经）外源钙处理的荷叶铁线蕨同源配子体性器官分化前后关键时期的基因组DNA甲基化水平差异及位点多态性差异，对性器官分化甲基化调控位点进行定位。运用RNA介导的DNA甲基化（RdDM）技术诱导初步定位的性器官分化调控位点的超甲基化，验证其功能，探讨性器官分化中DNA甲基化对基因表达调控的机理。

与种子植物相比，蕨类植物配子体结构简单、性器官分化及胚胎发育表型明显易于观察，是研究植物性器官分化及胚胎发育的理想材料。研究发现适量、适时的外源钙处理可促进荷叶铁线蕨配子体雌性性器官的分化及颈卵器数量的增多，透射电镜观测结果显示，经外源钙处理后的配子体胞内钙离子含量明显高于未经外源钙处理的配子体，钙离子主要分布于细胞膜边缘，这表明外源钙在配子体性器官形成和分化中起到了促进和调节作用。研究中还发现，经外源钙处理的配子体的部分后代可以产生多孢子体，它们即可通过不同位置的叶缘细胞进行无配子生殖形成单倍的孢子体，同时又可以在性器官形成区，通过有性生殖形成二倍的孢子体，而其体细胞胚形成及发育都处于生殖隔离状态。.　　　在基因水平上，运用HPLC、MSAP等技术，探讨DNA甲基化在荷叶铁线蕨配子体性器官分化及无配子生殖的胚胎发育中的作用。MSAP分析结果显示，荷叶铁线蕨基因组中约有26-30%的CCGG位点发生了胞嘧啶甲基化。1）经外源钙处理的同源配子体所形成的无性器官分化、有性器官形成与经外源钙处理后可产生多颈卵器的配子体：配子体性器官形成前后及多性器官形成时，甲基化比例均呈上升的趋势，在多性器官形成时达到最高，甲基化率与性器官数量呈明显线性相关，这与HPLC分析结果一致。产生多性器官的配子体其基因组超甲基化率与去甲基化率均明显增高。回收差异条带中与钙离子信号传导相关的WAK及WRKY转录因子同源性较高的较多。2）无配子生殖产生多孢子体的胚胎发育过程中，无胚组织时DNA总甲基为19.2%，胚性细胞团时DNA总甲基化水平下调至17.9%，胚芽时DNA总甲基化水平上调至20.1%，芽点时又下调至19.5%。超甲基化率最高的阶段是无胚组织到胚性细胞团，最低的为无胚组织到芽点；去甲基化率最高的也是无胚组织到胚性细胞团，最低的是无胚组织到胚芽，这表明DNA甲基化在胚胎发育不同时期具有特异性。本研究结果表明荷叶铁线蕨的性别分化和胚胎发育与DNA甲基化密切相关，为深入探讨DNA甲基化对相关基因的表达调控机理奠定了基础。.　　　本项目属于一年期的小额资助，在国家基金的资助下课题研究开展顺利，计划内容完成的同时还拓展了研究内容，为项目的深入研究打下了基础。培养研究生一名，正在撰写英文论文一篇。