融合单链抗体快速筛检多种残留抗微生物药物检测方法的研究

本项目在制备了三种（氯霉素，磺胺二甲嘧啶和环丙沙星）常见、常检的残留抗微生物药物的单克隆杂交瘤细胞株的基础上，继续探讨克隆、组装这三种的单链抗体后再串联融合表达的可能，通过实际样品的检测试验来鉴定融合多联单链抗体的敏感性、特异性和交叉性，最终以此多联特异性融合单链抗体为探针建立一种快速的免疫学检测方法，从而达到一次性、快速、筛检多种残留药物的目的。突出优势体现在：不仅正面的、充分的利用了单抗可能产生的广泛交叉谱进而筛检出多于三种的疑似残留药物，而且克服传统检验检疫中存在的设备昂贵、步骤繁琐、检测目标单一和费时耗力等缺点，轻松达到简便快捷灵敏高效的目的，更能详尽分析、比较不同类型抗体间的结合位点的特异性和功能域的差别。本项目如成功不仅为建立了多特异性单链抗体为基础的药物残留检测方法开辟出新思路，还奠定了小分子污染物快速筛检模式基础，还将进一步继续扩展和延伸其它污染物研究。

本项最终是建立一种用于同步筛检多种残留药物的快速免疫学检测方法的多联抗体。利用该多联抗体pGEX- CAP-CPFX-SM2，同时与相关的三种残留药物发生免疫学反应，所建立的方法也能同时筛检三种药物。具体分为一个基础和两个研究方向展开。基础为重氮化法偶联氯霉素和磺胺二甲嘧啶（CAP和SM2）的两种完全抗原，及其单克隆抗体的制备，并对纯化的抗体进行特异性和交叉谱等六个方面的特性鉴定。一方面从分子水平探讨，分别克隆、组装、串联和表达了CAP、SM2和CPFX的单链抗体及由三种药物串联的融合抗体pGEX- CAP-.CPFX-SM2，并对每种单链抗体的蛋白二级结构进行预测，对该多联融合抗体蛋白纯化分析。另一方面从免疫学角度出发，利用CAP和SM2纯化后的单克隆抗体，分别建立直接和间接竞争ELISA方法，获得拟合度良好的标准曲线后比较两类检测方法，对同一样品实样检测均具有较好的相关性；同时利用胶体金试纸初步组装了氯霉素金标检测试纸；并结合IL- HLLME-HPLC法测定酸奶中残留的磺胺类抗生素平行比较灵敏度。利用建立的优化ELISA条件分别检测纯化后的三种单链抗体和融合抗体，并平行比较相对应的单克隆抗体、单链抗体和融合抗体。结果显示利用融合单链抗体同步筛检三种药物的方式可行，为我国畜禽进出口中的快速检测提供了可靠的方法基础，并为小分子污染物的检测开辟新的研究思路。