NADPH氧化酶在钙化性主动脉瓣膜病中的作用研究

Calcific aortic valve disease (CAVD), a major clinical problem facing aging societies, is an actively regulated calcification process characterized by differentiation of aortic valvular interstitial cells (AVIC) toward an osteogenic-like phenotype. Emerging evidence indicates that reactive oxygen species (ROS) levels increase in aortic valve (AV) stenosis, however the sources of ROS and their roles in the pathogenesis of CAVD are elusive. NADPH oxidases (Nox) are important cardiac ROS-generating enzymes but the contributions of Nox in the (patho)physiological process of cardiovascular diseases are tissue-specific and isoform-dependent. The most abundant isoforms in the heart are Nox2 and Nox4. We and others demonstrated that Nox2 is detrimental but Nox4 beneficial in the process of adverse cardiac remodeling, the findings raising the question whether the distinctive involvement of Nox isoforms may provide potential targets for therapeutic manipulation in the development of CAVD. This project will investigate: (a) the spatial heterogeneity of Nox expressions in normal aortic valves, and their changing profiles with the development of CAVD in rabbits and patients; (b) the roles of Nox2/4 for the osteoblastic differentiation on cultured AVIC transduced with either adenoviral vectors overexpressing Nox2/4 or the short-hair pin sequences targeted against Nox2/4; (c) the interaction between endothelial cells and AVIC, and the paracrine effects of Nox2/4 on AVIC calcification; (d) mechanisms involved in such modulation; e) the protective effect of Nox inhibitor against CAVD in rabbit.

钙化性主动脉瓣膜病(CAVD)是老年社会所面临的严重临床问题，其主要表型特点是主动脉瓣膜间质细胞(AVIC)向成骨样细胞转化。活性氧(ROS)在CAVD中显著升高，但其来源及对细胞钙化的作用和机制仍不清楚。NADPH氧化酶(Nox)是重要ROS 来源，其在心血管疾病中作用是细胞特异性的。心脏主要表达Nox2和Nox4，研究显示在病理性心肌重构的过程中Nox2是有害的，但Nox4则起保护作用，Nox的这种特殊性为探讨瓣膜钙化的发病机制及其防治提供了新的靶向。本课题将从细胞﹑组织﹑动物和患者标本等多层次研究Nox在CAVD中的作用: 1.检测Nox不同亚型在正常瓣膜上的组织细胞特异性表达及在CAVD病变发展中的变化；2.明确Nox2/4对培养的AVIC钙化的影响；3.探讨内皮细胞和AVIC的相互作用及Nox2/4的旁分泌效应；4.可能的机制研究；5.观察 Nox抑制剂对兔CAVD的保护作用。

钙化性主动脉瓣膜病（CAVD）是继冠心病和高血压之后的第三大心血管疾病，但临床缺乏有效防治药物。活性氧（ROS）参与CAVD，但ROS的来源及其对钙化的调控作用仍不清楚。NADPH氧化酶（Nox）是重要ROS 来源，其主要亚型Nox2和Nox4参与多种心血管疾病的病理生理学调节，然而其不同亚型的表达﹑活性和在心血管疾病中作用是组织细胞特异性的，Nox的这种特殊性为探讨瓣膜钙化的发病机制及其防治提供了新的靶向。本课题从细胞﹑组织﹑动物和患者标本等不同层次全面研究了Nox在CAVD中的作用，取得了一些有意义的实验结果。.1..Nox在猪主动脉瓣膜的生理性表达具有组织和细胞特异性。Nox2和Nox4在猪主动脉瓣膜根部的蛋白水平显著高于尖部和中部，这与瓣膜钙化病变的进展是一致的；Nox4在内皮细胞中的表达水平明显高于瓣膜间质细胞（AVIC），但Nox2蛋白含量在间质细胞中显著高于内皮细胞。.2..Nox2上调促进AVIC钙化，雷公藤红素可显著减轻兔CAVD。原代培养的猪AVIC钙化过程中，ROS含量升高，Nox2蛋白表达持续增加，并在钙化晚期维持在高水平；利用腺病毒载体敲低内源性Nox2可显著减轻AVIC钙化，相反，高表达Nox2可明显促进AVIC钙化。其机制与激活GSK3β/catenin信号通路介导的细胞纤维化有关；雷公藤红素有抑制Nox2活性的作用，可以显著抑制AVIC 钙化，其效果和机制与shNox2内源性降低Nox2表达后的作用相似；成功复制新西兰大白兔CAVD模型，兔子口服雷公藤红素可显著减轻瓣膜纤维化、钙化和狭窄，并且心功能得到明显改善。而且，这一药物剂量没有肝肾毒副作用，是安全有效的；兔子钙化瓣膜中Nox2表达显著升高，雷公藤红素可抑制Nox2上调；检测CAVD患者瓣膜标本，发现钙化瓣膜严重区域Nox2表达也明显升高。.3..初步探讨了Nox4在CAVD中的作用。通过腺病毒载体过表达Nox4，发现增加Nox4水平对AVIC钙化有明显的抑制效应；初步资料显示， Nox4基因敲除小鼠的CAVD减轻。这一部分工作特别是其机制研究仍在进行中。.综上，Nox在CAVD中起重要作用。特别是，Nox2介导的GSK3β/catenin信号通路激活促进AVIC的纤维化和钙化，雷公藤红素通过抑制Nox2有望成为防治CAVD新的药物。