肝脏非实质细胞对卵圆细胞增殖的动态调控作用机制研究

Hepatic stem cell niche plays an important role in hepatic oval cell(HOC)-mediated liver regeneration. As a component of hepatic stem cell niche, the role of hepatic nonparenchymal cells(HNPCs) in oval cell proliferation needs further studies. Recent studies declared that HNPCs such like Kupffer cells (KC) and hpeatic stellate cell(HSC) promote proliferation of HOC via cytokines and extracellular matrix(ECM). But they ignored a important fact : the phenotype of HNPCs kept changing in the process of HOC proliferation and resulted in the variation of cytokine and ECM expression profile of HNPCs, which might lead to the dynamic change of regulational effect of HNPCs on oval cell proliferation. Based on this fact and our preliminary work, we speculate that the regulation effet of HNPCs on proliferation of oval cells keeps dynamic change in the process of HOC-mediated liver regeneration. In order to confirm our hypothesis, we plan to delete HNPCs or KC alone or KC plus HSC in different phases of oval cell mediated liver regeneration, and detect the change of oval cell proliferation. Furthermore, we will establish KC-HSC co-culture model to detecte the effect of KC-HSC interaction on the phenotype of KC and HSC, and the proliferation of OC. Finally，we could definite the mechanism of the dynamic regulation effect of HNPCs on oval cell proliferation, which is key theoretical basis for the clinical application of hepatic stem cell replacement therapy.

肝脏卵圆细胞的增殖受到肝脏微环境的精细调控。新近研究发现肝脏微环境的重要组成部分-肝脏非实质细胞，如Kuppfer细胞和肝星状细胞可以通过其分泌的细胞因子或细胞外基质促进卵圆细胞的增殖。但是相关研究均忽略了一个重要事实：伴随着卵圆细胞的增殖，肝脏非实质细胞表型的动态变化，以及细胞之间的相互作用，使其分泌的细胞因子、细胞外基质成分动态变化。基于此及我们的前期工作，我们推测肝非实质细胞对卵圆细胞的调控作用是动态变化的。为了验证上述的假说，本课题拟在卵圆细胞增殖的不同阶段清除Kupffer细胞、联合清除Kupffer细胞和肝星状细胞，观察卵圆细胞增殖的变化；同时在体外建立Kupffer细胞-肝星状细胞共培养模型，观察Kupffer细胞-肝星状细胞相互作用对彼此表型及对卵圆细胞增殖的调控作用。初步阐明肝脏非实质细胞对卵圆细胞增殖的动态调控作用及机制，为肝脏干细胞移植提供新的思路和理论基础。

肝脏卵圆细胞（HOCs）的增殖受到肝脏微环境的精细调控。HOCs介导的肝再生过程中，肝脏非实质细胞（HNPCs）表型、细胞相互作用，分泌细胞因子、细胞外基质成分动态变化。我们推测肝非实质细胞对HOCs的调控作用是动态变化的。因此利用2-AAF/PH大鼠HOCs介导肝再生模型，首先使用gliotoxin在肝再生不同阶段清除以Kuppffer 细胞（KCs）和HSCs 为主的HNPCs，发现在HOCs 介导的肝再生的初期阶段，以KCs和HSCs 为主的HNPCs 通过外分泌各种细胞因子，启动及支持HOCs 的增殖和活化；在HPCs增殖的晚期阶段，KCs 和HSCs 通过分泌HOCs 增殖的负调控因子，抑制HOCs 增殖，促进其凋亡和分化。我们在HOCs介导肝再生的不同阶段清除KCs，发现在肝再生的初期阶段清除KCs， 可抑制HOCs 的增殖，同时可降低HSCs 的活化程度。而在肝再生晚期清除KCs对HOCs 的增殖没有显著的影响。我们随后研究KCs和HSCs的协同作用，使用左旋半胱氨酸（L-cysteine）预先清除HSC 的大鼠制作2‐AAF/PH 模型，发现HOCs 增殖在初期明显受抑制，但KCs 增殖活化明显，分泌多种HOCs增殖正调控细胞因子，同时HSCs 分泌的HOCs 负调控因子表达降低，因此代偿性促进HOCs 在后期增殖，完成肝再生。而在卵圆细胞增殖的不同阶段清除KC，均可抑制HOCs 的增殖。体外共培养KCs 和HSCs，发现KCs可诱导HSCs 的激活和增殖，诱导HSCs 分泌HOCs 增殖相关细胞因的表达，KCs 与HSCs 共培养获得的条件培养基可促进HOCs 细胞系WB‐F344 和LE6 的增殖。因此我们得出结论，HOCs介导的肝脏再生受到肝脏非实质细胞HNPCs的动态调控，早期HNPCs通过旁分泌各种细胞因子促进HOCs的增殖分化，晚期则通过负调控因子抑制HOCs的增殖，终止肝再生。KCs不仅可直接促进HOCs的增殖，还可已通过激活HSCs间接促进HOCs增殖。在HSCs活化受抑制的情况下，KCs可代偿性活化，弥补HSCs部分功能，促进肝脏再生。本项目研究成果揭示了肝脏干细胞增殖调控的重要机制，第一次证实了肝脏非实质细胞对肝脏干细胞增殖的动态调控作用和非实质细胞之间的协同作用，为今后干细胞治疗、定向调控肝脏干细胞的增殖提供理论支撑和作用靶点。