人参皂苷脑内作用靶点14-3-3蛋白的确证和阐释

By means of pull-down technique, we previously found that 14-3-3 protein might be a target of ginsenosides in brain tissues, which has direct interaction with protopanaxadiol and protopanaxatriol, two metabolites of ginsenosides in vivo. First, for target confirmation from multiple perspectives, this project intends to detect the affinity parameters between protopanaxidiol (as a representative) and 14-3-3 protein via biolayer interferometry technique, microscale thermophoresis technique and isothermal titration calorimetry, and analyze the binding sites via molecular docking software. Second, considering that GSK 3β is one of the target proteins of 14-3-3 protein, the project intends to determine how ginsenosides protect hippocampal structural plasticity by GSK 3β-CREB-BDNF signal transduction pathway, one of the target pathways of 14-3-3 protein. For target explanation, in vivo and in vitro experiments combined with the technique of virus plasmid overexpression will be employed. Through perfecting the evidence chain of “target-mechanism-effect”, the project is helpful to reveal the complex mechanism of ginsenosides against stress-induced neurologic damage, and provides a strong evidence for ginsenosides to prevent and treat stress-induced depression-like behavior. Therefore, it promotes the clinical application of ginseng in the field of psychiatry and neurology and the development of innovated Chinese herbal medicine.

课题组前期通过“亲和垂钓”靶点发现方案得出14-3-3蛋白可能是人参皂苷脑内作用靶点之一，其与人参皂苷体内代谢产物原人参二醇、原人参三醇有直接相互作用。首先，本项目拟以原人参二醇为代表，采用生物膜层干涉技术、微量热泳动技术及等温滴定量热技术测定其与14-3-3蛋白间的亲和常数，并利用分子对接软件分析结合位点，从多角度进行靶点验证；其次，基于GSK 3β是14-3-3蛋白的靶蛋白之一，项目拟从14-3-3蛋白的靶通路GSK 3β-CREB-BDNF入手，通过体内外实验，结合过表达病毒质粒从正反两方面阐释人参皂苷通过结合14-3-3蛋白保护海马结构可塑性的机理。本项目通过完善“靶点-机制-药效”证据链，有助于揭示人参皂苷抗应激致神经病变的复杂机制，为应用人参防治应激所致的抑郁样行为提供有力证据，进而推动人参在神经精神领域的临床应用及创新中药开发。

项目背景：1、14-3-3蛋白是否是人参皂苷的脑内作用靶点之一尚未得到确证。2、 尚不清楚人参皂苷苷元与14-3-3蛋白的结合是否影响14-3-3蛋白与GSK 3β的结合及GSK 3β的酶活。3、人参皂苷的抗抑郁作用是否与结合其脑内靶点14-3-3蛋白，进而影响CREB-BDNF信号转导通路有关。研究内容：项目设计主要围绕三方面进行，1、靶点初筛：亲和垂钓进行靶点初筛。2、靶点确证：利用生物膜干涉技术(BLI)、等温滴定量热技术(ITC)、共结晶解析技术及氨基酸定点突变进行多角度验证。3、靶点阐释：基于14-3-3ζ蛋白的靶通路 GSK 3β-CREB-BDNF阐释原人参二醇抗抑郁的作用机理。重要结果：1、亲和垂钓发现14-3-3ζ蛋白是人参皂苷脑内潜在的蛋白质靶点之一。2、BLI技术发现人参皂苷体内代谢产物原人参二醇与脑内14-3-3ζ蛋白有较强的直接相互作用。3、BLI、ITC、共结晶解析技术及氨基酸定点突变多角度确证14-3-3ζ 蛋白为原人参二醇的脑内蛋白质靶点。4、原人参二醇通过结合14-3-3ζ蛋白，促进了14-3-3ζ蛋白与Ser9磷酸化的GSK 3β的结合，促进了GSK 3β的磷酸化，并降低了GSK 3β的酶活，激活了CREB-BDNF信号转导通路。学术意义：1、这种基于靶点探究、而非传统上由药效推测人参皂苷保护海马结构可塑性的机理，为人参在神经精神领域的应用提供有力证据。2、该研究方法也适用于其它中药靶点的发现，对“靶点-机制-药效”证据链的完善将有助于推动中药的临床应用及创新中药开发。