产气荚膜梭菌肠毒素肽段与Claudin-5的特异性结合对血脑屏障通透性调控的研究

紧密连接（Tight junction, TJ）在生物体不同器官或组织中起着调节细胞间通透性的作用。Claudin是构成TJ的一类重要的跨膜蛋白。最新研究表明，产气荚膜梭菌肠毒素（Clostridum perfringens enterotoxin, CPE）能与Claudin家族的部分成员特异性结合，增强TJ的通透性。本课题拟借助TAT蛋白转导肽高效的跨膜转运和亚细胞定位技术，将产气荚膜梭菌肠毒素C端肽段（C-CPE）导入脑微血管内皮细胞中，与跨膜整合的Claudin-5结合，同时阻断细胞内分泌型Claudin-5的跨膜定位，短暂性抑制内皮细胞间紧密连接的形成，增强内皮细胞间隙通透性。在体外实验的基础上，利用斑马鱼作为体内实验的模式动物，分析C-CPE对斑马鱼血脑屏障渗透性的影响。本研究将为通短暂性调控血脑屏障的通透性，向脑或中枢神经系统高效快速地投递药物的临床应用奠定实验基础。

本课题拟借助产气荚膜梭菌肠毒素C 端肽段等多肽（C-CPE）与紧密连接蛋白家族成员Claudin的特异性结合来尝试抑制血管内皮细胞间紧密连接的形成，从而达到调控血脑屏障及其他组织屏障的通透性的目的。在项目执行期内，我们主要围绕以下几个主要方向进行了研究，取得了如下进展和成果：.1.利用鼠脑血管内皮细胞bEnd.3建立了评估和检测血管内皮细胞单细胞层紧密性的模型；.2.在野生型C-CPE与Claudin-5结合效率较低的情况下，优化和构建了双氨基酸突变型C-CPE-muta，使其与Claudin-5的结合效率显著增强。基于体外细胞实验的研究标明，C-CPE-muta与bEnd.3结合后导致其细胞膜上的Claudin-5降解，细胞间跨膜通透性（TER）明显增强，撤去C-CPE-muta后，TER在24小时内得以恢复，从而达到了对血管内皮细胞层紧密性的可逆性调节；.3.利用Morpholino对斑马鱼胚胎Claudin-5特异性沉默后发现，Claudin-5的缺失导致胚胎血管特别是脑血管发育延缓和畸形，72小时发育阶段血脑屏障功能形成后，通过微血管造影技术评估脑血管通透性揭示，Claudin-5的缺失导致了血脑屏障通透性的增强，为C-CPE-muta结合和降解Claudin-5后对血脑屏障通透性的改变奠定了实验基础；.4.在平行的对照实验中，我们利用免疫炎症因子及干扰素γ（IFN-γ）作为内皮屏障通透性改变的正负对照，通过细胞实验和小鼠模型发现IFN-γ在脑自发性免疫炎症及脑脊髓炎中对血脑屏障具有保护作用，进一步实验证实了Claudin-5, ZO-1, Occludin等紧密连接蛋白在脑自发性免疫炎症中能被IFN-γ刺激上调，从而起到保护血脑屏障功能的作用；.5.我们意外研究发现，利用野生型C-CPE对斑马鱼胚胎进行孵育，C-CPE能与斑马鱼胚胎表皮的Claudin-4蛋白结合破坏胚胎表皮细胞间紧密连接结构，从而影响皮肤表皮屏障。. 通过此课题的研究，我们共培养硕士研究生4名，发表论文6篇，其中SCI论文3篇，参加国内学术会议并提交相关研究成果两次。. (详细信息请参考报告正文部分。)