酿酒酵母DNA复制蛋白Mcm10促进复制解旋酶Mcm2-7激活的分子机制

The initiation of DNA replication is strictly regulated in eukaryotes. The core components of the replicative helicase，Mcm2-7，are loaded as an inactive double hexamer (DH) onto origins，to form the pre-RC during G1 phase. After the formation of pre-RC，the Cdc45，GINS and other replication factors assemble on origins，and the pre-IC is formed. This reaction requires S-CDK and DDK. Once the pre-IC is activated by MCM10 ,DDK and other activators，the active Cdc45-Mcm2-7-GINS complex is formed，and then DNA replication fork is established. So far，the molecular mechanisms of the activation of DNA replicative helicase Mcm2-7 by Mcm10 remains elusive. We’ll resolve structures of the MCM10-DH super complex by cryo-electron microscopy. Combines with genetic and biochemical approaches，mutations of Mcm10-DH interfacial interface will be constructed to explore the relationship between Mcm10-DH conformation and helicase activity，which may shed light on the molecular mechanism of Mcm2-7 activation.

真核生物DNA复制起始受到机体的严格调控。在G1期，复制解旋酶的核心组分Mcm2-7以无活性的双六聚体构象 (double hexamer，DH) 装载到复制原点形成pre-RC。当细胞进入G1/S期，激酶S-CDK和DDK行使其功能，将Cdc45、GINS等DNA复制因子招募至pre-RC形成pre-IC。直至S期，pre-IC在Mcm10、DDK等解旋酶激活因子的作用下，形成具有解旋酶活性的Cdc45-Mcm2-7-GINS (CMG) 复合体，起始DNA复制。迄今，Mcm10激活复制解旋酶的具体机制尚不明确。本项目拟通过冷冻电镜技术解析Mcm10与Mcm2-7双六聚体形成的超复合体（Mcm10-DH）的高分辨率结构。并结合遗传与生化手段，对Mcm10-DH互作界面进行突变或互补分析，探讨Mcm10-DH构象与解旋酶活性之间的关系，将有助于揭示解旋酶Mcm2-7激活的分子机制。

DNA复制是最基本的生物学过程之一，所有生命的生长和繁殖都需要DNA的精确复制和传递。DNA复制研究不仅具有生物学基础理论意义，而且在基因组不稳定性引起的重大疾病的医学研究、诊断和治疗中占有重要地位。.在真核生物DNA复制进程中，复制机器的组装与激活极受到机体的严格调控。在G1期，复制解旋酶的核心组分Mcm2-7（MCM）以无活性的双六聚体构象(double hexamer，DH)装载到复制原点形成pre-RC。当细胞进入G1/S期，激酶S-CDK和DDK行使其功能，将Cdc45、GINS等DNA复制因子招募至pre-RC形成pre-IC。直至S期，pre-IC在Mcm10、DDK等解旋酶激活因子的作用下，形成具有解旋酶活性的Cdc45-Mcm2-7-GINS (CMG) 复合体，起始DNA复制。迄今，Mcm10激活复制解旋酶的具体机制尚不明确。.本研究以酿酒酵母为材料，探究了酵母细胞解旋酶CMG在激活过程中的组分和构象变化。无活性的DH是由两分子的MCM组成，因而为了捕捉到CMG激活过程中的MCM相关的中间态复合体，我们首先在酵母细胞中引入了两分子的Mcm4，并由两个不同的标签进行标记。之后通过双标签串联亲和层析纯化含有两个MCM的复合体。免疫印迹和质谱分析显示，DH在激活过程能够与共激活因子Cdc45、GINS形成一种全新的中间态复合体。通过甘油密度梯度离心实验发现该复合体包含两个MCM、两个Cdc45和两个GINS，我们将其称之为“double-CMG (d-CMG)”。之后，我们借助电镜观察到在MCM相关复合体中有d-CMG存在，但其所占比例较低。此外，在大肠杆菌中过量表达并分离纯化了酵母和人细胞的Mcm10蛋白，并通过分子筛层析发现Mcm10存在单体和多聚体两种状态。我们通过负染和冷冻电镜解析了多聚化Mcm10的结构。结果显示，酵母细胞的Mcm10蛋白可以形成同源六聚体，且六聚体的各亚基均匀排布环成了一个中空的桶装结构。之外，我们还发现人细胞的Mcm10和GINS可以形成稳定的复合体。.本研究发现在DNA复制起始过程中，无活性的解旋酶DH首先组装成d-CMG复合体；随后该复合体迅速转变为两个激活状态的CMG。同时发现解旋酶激活因子Mcm10存在单体和多聚体两种状态，为阐明真核生物DNA复制解旋酶激活的全过程提供了线索。