大鼠急性心肌缺血早期基因标记物筛选及功能研究

心源性猝死在猝死的法医学鉴定中最为常见，有研究报道，猝死过程在1 小时之内者，60-70%都存在不同程度的心肌缺血，但目前尚无确切有效的早期心肌缺血诊断指标。课题组前期研究运用抑制消减杂交筛选了大鼠急性心肌缺血1小时的差异表达基因，发现了四个可能与心肌缺血有关的已知基因和七个未知序列表达标签（EST）。本研究拟采用免疫组化、western blot、原位杂交、实时荧光定量PCR和RNA干扰等方法进一步验证这四个已知基因在大鼠急性心肌缺血中的作用，并运用RACE技术克隆未知EST全长后与基因库比较：若是已知基因，则研究其与急性心肌缺血的相关性；若是新基因，将运用生物信息学技术预测其结构和功能，构建新基因真核表达质粒，运用多种现代生物学技术研究其对心肌细胞缺血缺氧的影响，旨在寻找到更有价值的特异性心肌缺血早期分子标记，为急性心肌缺血早期诊断提供理论依据，为心源性猝死的法医学鉴定提供新途径。

课题组前期运用抑制消减杂交筛选了大鼠急性心肌缺血1小时的差异表达基因，发现了四个可能与心肌缺血有关的已知基因（Basigin、Cathepsin L、Sjogren syndrome antigen B和Unc-45 homolog A）和七个未知序列表达标签EST。本课题运用免疫组化、western blot、原位杂交和实时荧光定量PCR等方法进一步验证这些基因在大鼠急性心肌缺血中的作用。研究发现，大鼠急性心肌缺血后Bsg、Cathepsin L、SS-B和Unc45a mRNA表达均呈下降趋势。与0 min缺血心肌(EIM)及正常对照心肌(NOM)组相比，Basigin mRNA 在心肌持续缺血15min-240min的表达显著降低(P <0.05)，持续缺血30min-240min，缺血心肌(EIM)的表达量较非缺血心肌(NIM) 明显降低(P<0.05)。CathepsinL在急性心肌缺血120min时间点的表达明显降低，与30min和60 min时间点相比，差异具有统计学意义（P＜0.05）。SSB基因在急性心肌缺血120min，与心肌缺血0min及正常对照组相比，差异具有统计学意义（P＜0.05）。UNC45 a mRNA在心肌缺血30min、60min和120min组表达明显降低，与正常组相比，差异有统计学意义（P<0.05）。心肌缺血1小时后， SSB蛋白表达亦明显降低，与心肌缺血0分钟相比，SSB蛋白在1小时和6小时的表达差异具有统计学意义（P＜0.05）。Basigin蛋白在缺血心肌(EIM)表达较0 min缺血心肌(EIM)、非缺血心肌(NIM)和正常对照心肌(NOM)增高2倍左右(P<0.05)。此外，成功制备了兔抗Unc45 a多克隆抗体。前期筛选出的未知EST序列为UGP2，免疫组化和免疫印迹结果显示UGP2 mRNA和蛋白在急性心肌缺血后均呈低表达。这些研究结果提示，Bsg、Cathepsin L、SS-B、Unc45a和UGP2有望成为急性心肌缺血早期的生物学标记物，在心源性猝死，尤其是发病急促、无明确组织病理学改变的法医学鉴定中具有潜在的应用价值。