新疆珍稀核桃露仁性状相关基因克隆及其功能验证

Xinjiang is one of the important walnut-producing areas in China. Germplasm of Xinjiang rare walnut "wen 138" is the preferred raw material resources of the Walnut further processing because of its thinner shell, partial degraded shell and bared-nut when cracking. Nut shell's sclerosis of walnut is caused mainly by lignin deposition of cell wall secondary metabolites. However, "wen138" walnuts' bared-nut phenomenon, and its associated lignin metabolites' genes and function are not clear. Xinjiang's rare bared-nut walnut "wen138" used as study materials, and its bud variation parent "zhipi" as control. "wen138" walnut bared -nut mechanism was studied, and bared-nut molecular mechanism was clarified by a series of research methods, containing cloning and spatial-temporal expression of shell-cracking related genes FUL and SHP, RNA-Seq and analysis, transgenic functional characterization of selecting key genes, electron microscopy observation of lignin deposition process, and assaying of substance and enzyme activity during lignin metabolites. This study aims at laying the foundation for speculating the formation mechanism of walnut endocarp, developing walnut's endocarp growth research and breeding high-quality bared-nut walnut, which has great significance for protecting and utilizing of Xinjiang's characteristic walnut resources.

新疆是我国的重要核桃产区之一。新疆珍稀核桃种质"温138"果壳极薄，壳面部分退化、开裂造成露仁，是核桃深加工的首选原料资源。核桃果壳的硬化主要是由细胞壁次生代谢物木质素的沉积造成，但是"温138"核桃露仁现象及其与之相关的果壳硬化过程中木质素代谢相关基因及其功能尚不清楚，本项目以新疆珍稀露仁核桃种质"温138"为研究材料，其芽变亲本"纸皮"为对照，集成开裂相关基因FUL和SHP的克隆与时空表达，转录组测序、分析及候选关键基因转基因功能验证，透射电镜观察木质素沉积进程，木质素代谢途径中物质及酶活测定等研究手段，深入研究"温138"露仁机制，阐明核桃露仁分子机理。开展本项目研究，为推测核桃内果皮形成机理，开展核桃内果皮发育研究及其培育高品质露仁核桃奠定基础，对新疆特有核桃资源的品种保护、科学利用等具有重要意义。

‘温138’核桃子房内壁细胞疏松，形成层不紧致，内壁细胞未分化完全，发育异常，子房内壁出现断裂细胞，‘温138’在盛花后64天内果皮开始木质化，‘纸皮’在盛花后57天内果皮开始木质化；核桃内果皮硬化过程中‘温138’核桃纤维素、半纤维素、木质素、葡萄糖、阿魏酸五种物质含量低于‘纸皮’核桃。木质素代谢过程中三个关键基因被克隆，分别是苯丙氨酸解氨酶（PAL）、4-香豆酸辅酶A连接酶（4CL），肉桂酰辅酶A还原酶（CCR）。表达分析发现，在内果皮硬化期，纸皮核桃基因表达量明显高于温138核桃。转录组研究显示，获得77 570 条 Unigene，检测到 168 条条件特异表达基因，其中，“纸皮”核桃中有 108 条，“温138”核桃中有 60 条。与 KEGG 数据库比对，有 361 条 Unigene 与木质素的生物合成有关，有 110 条 Unigene 直接参与木质素合成中的 11 种关键酶的形成，其他的 251 条 Unigene 则参与在木质素合成的整个过程当中。比较“纸皮”核桃与“温138”核桃中木质素代谢关键酶基因，发现在6月13日，与 PAL 相关基因的表达量表现为：在“纸皮”核桃中的表达量高于“温138”核桃；其他关键酶基因的表达量也普遍表现为“纸皮”核桃高于“温138”核桃。在三个发育时期中，多数关键酶基因的表达趋势在“纸皮”核桃中呈先上升后降低，在“温138”核桃中则表现为依次升高。“温138”核桃中木质素合成初期所积累的木质素合成过程中的中间产物不足，是导致后期木质素的合成受影响，进而导致“温138”核桃出现露仁现象的可能原因。