SNARE蛋白VAMP721和VAMP722在生长素运输载体动态转运中的功能研究

SNARE proteins mediate the complex vesicle trafficking by which the dynamic protein delivery is accomplished in endomembrane system of living cells. In plants, auxin flow and gradient in plant cell and tissue are modulated by the dynamic trafficking of auxin transporters. However, little information is known about the molecular mechanism of the dynamic trafficking of auxin transporters mediated by SNARE proteins. In the present study, we will investigate the function of Arabidopsis v-SNARE proteins VAMP721 and VAMP722 in the subcellular distribution and trafficking of auxin transporters by means of dynamic imaging in the living cells together with genetic approaches. First, we will analyze the phenotypes related to the defects in polar auxin transport by using VAMP721/VAMP722 homozygous double mutant. Then, we will determine the subcellular localization of auxin transporters in double mutant. Finally, we will further explore the mechanism for VAMP721 and VAMP722 involved in intracellular trafficking of auxin transporters. In the course of the investigation, some new methods and techniques including new fluorescent protein labeling, fluorescence recover after photobleaching and fluorescence correlation spectroscopy, will be used in this study with the aim of uncovering the function of vesicle trafficking mediated by VAMP721 and VAMP722 in the polar targeting and intracellular trafficking of auxin transporters. Surely, the results of this study will lay foundation for the further investigation of molecular mechanism for polar auxin transport in plant cells.

SNARE蛋白介导了内膜系统中复杂的囊泡运输，实现了功能蛋白在胞内的动态转运。前人研究表明，植物细胞中生长素运输载体的动态转运调控了生长素在组织细胞中的流向和梯度分布。然而，有关SNARE蛋白介导生长素运输载体动态转运的分子机制缺乏相关研究。本项目针对前人工作的不足，以拟南芥为材料，着重展开三方面的研究：(1)观察分析SNARE VAMP721/VAMP722双突变体中生长素极性运输缺陷相关的表型；(2) 研究生长素运输载体在双突变体细胞中的亚细胞定位；(3) 探讨VAMP721和VAMP722蛋白参与生长素输运载体胞内转运的分子机理。在本项目研究中，拟采用新型荧光蛋白标记、光漂白恢复和荧光相关光谱等一些新方法、新技术，旨在揭示VAMP721和VAMP722蛋白介导的囊泡运输在生长素运输载体的极性定位和胞内转运中的作用，对进一步揭示生长素极性运输的分子机理具有重要的科学意义。

SNARE蛋白复合体是由定位在靶膜上的Q-SNARE和囊泡膜上的v-SNARE组成，介导了内膜系统中囊泡与靶膜的融合，实现了功能蛋白在胞内的动态转运。生长素是调控植物生长发育所必需的一类重要的植物激素，生长素运输载体的定位和胞内转运决定了生长素在组织细胞中的流向和梯度分布。然而，迄今为止，植物细胞中参与生长素输出载体PIN 蛋白转运的v-SNARE 蛋白尚未报道。本项目主要研究了拟南芥R-SNARE蛋白VAMP721和VAMP722在生长素运输载体极性定位和胞内转运中的功能。研究结果表明，vamp721vamp722突变体导致幼苗子叶发育异常，叶脉紊乱，不规则，不连续完整。与对照相比，vamp721vamp722幼苗根冠细胞淀粉粒分布紊乱，而且生长素标记蛋白分布模式也异常。PIN1-GFP在突变体幼苗根细胞中异常聚集，形成大的点状，细胞基部的极性定位相对减少。PIN2-GFP在突变体幼苗根细胞质中异常表达，表现为小点状、弥散状分布，质膜上的极性定位发生变化，细胞质膜的侧边也有表达。囊泡运输抑制剂BFA去除实验表明，对照细胞中PIN2-GFP恢复到质膜定位。但是，vamp721vamp722突变体细胞中BFA聚集体仍显著存在，表明VAMP721和VAMP722介导的囊泡运输参与PIN2分泌到质膜上的转运。细胞器标记蛋白定位分析表明，vamp721vamp722突变导致早期内涵体-TGN结构发生变化，形成聚集体，暗示了突变体影响功能膜蛋白的分泌运输。此外，与野生型相比，vamp721vamp722突变体真叶发育畸形、迟缓，没有表皮毛；突变体根细胞质膜完整性和细胞活性降低，根细胞中异常聚集了纤维素，胼胝质和木质素，而且vamp721vamp722突变导致胚胎发育异常。上述结果揭示了VAMP721和VAMP722标记的囊泡可能通过调控生长素运输载体的亚细胞定位和胞内转运参与植株的生长发育，也为深入研究v-SNARE蛋白在植物生长发育中的作用奠定理论基础。