脑型疟中新型粘附分子PIESP2参与感染红细胞与脑微血管内皮细胞粘附的机制

Malarial is one of the most common infectious diseases in the world. After parasite infection, some patients develop cerebral malaria which accounts for most malaria mortality. Previous investigations have demonstrated that the cytoadherence of parasitized red blood cells (pRBCs) to brain microvascular endothelialcells (BMEC) was the main cause of cerebral malaria. Although several parasite proteins were shown to mediate the adhesion interaction between pRBC and BMEC, we are still far from understanding the mechanism of cerebral malaria. To further unravel the molecular mechanism of this disease, new parasite protein involved in the adhesion between pRBC and BMEC should be identified. By the method of digital protein, we identified 243 candidate adhesion proteins, including the proteins proved to mediate cytoadherence of pRBC to BMEC and novel proteins whose functions were not elucidated yet. Through preliminary experimental investigation, we found the parasite protein PIESP2 participates in the adhesion between pRBC and BMEC, however, the underlying molecular mechanism of this phenomenon was not clear. In this study, in order to understand how PIESP2 mediates the cytoadherence of pRBC to BMEC, we will identify the interactant of PIESP2 on BMEC surface，demonstrate the effect of PIESP2 stimulation on BMEC function and evaluate its relations to occurrence of cerebral malaria. Our investigation will further unravel the molecular mechanism of cerebral malaria.

疟疾是全球三大传染病之一。部分病人感染恶性疟原虫后可出现脑型疟，死亡率极高。研究表明，疟原虫感染的红细胞（pRBC）与脑微血管内皮细胞（BMEC）粘附性增高是导致脑型疟发生的主要原因。虽然已有少数恶性疟原虫分子被发现参与了pRBC与BMEC的粘附，但仍不能完全解释脑型疟的发生机制。寻找并发现新的参与pRBC与BMEC粘附的蛋白分子有助于深入阐明脑型疟的发生原因。我们提出并使用数字蛋白方法鉴定到243个候选粘附分子，既包括那些已知的参与pRBC粘附的蛋白分子，又包括许多新的候选分子。通过初步研究，我们发现候选分子PIESP2参与了pRBC的粘附，但相关机制尚不清楚。本课题拟在前期发现的基础上，进一步阐明PIESP2参与pRBC粘附的机制。我们将鉴定出PIESP2在BMEC中的相互作用分子，揭示其对BMEC功能的影响，评价PIESP2与脑型疟发生的关系。该研究有助于进一步解释脑型疟的发生机制。

脑型疟是导致疟疾患者死亡的主要原因，由恶性疟原虫感染引起。为发现恶性疟原虫中哪些分子参与了脑型疟的发生，我们创建了虚拟基因组技术。通过虚拟基因组技术，我们发现恶性疟原虫特有蛋白分子PIESP2可能与脑型疟的发生有关。为明确PIESP2在脑型疟发生中的作用，我们将PIESP2的胞外域克隆入表达载体，提取并纯化PIESP2胞外域蛋白分子，通过接种小鼠，获得了高效价高特异性的PIESP2免疫血清。在此基础上，我们通过细胞间接免疫荧光实验和流失细胞术详细研究了PIESP2在感染红细胞中的表达及定位，发现在裂殖体早期可有部分PIESP2蛋白分子可表达于感染红细胞膜的表面。为明确PIESP2蛋白分子是否可以介导感染红细胞与脑微血管内皮细胞（BMEC）的粘附，我们用免疫血清封闭感染红细胞膜上的PIESP2蛋白分子，然后进行红细胞计数及疟原虫DNA定量实验。结果表明，封闭PIESP2蛋白分子可明显抑制感染红细胞与BMEC的粘附。进一步，我们将PIESP2蛋白与BMEC共孵育并行Western blot实验，发现PIESP2蛋白分子可与BMEC直接结合。为发现PIESP2在BMEC细胞膜上的相互作用分子，我们采用Co-IP实验联合质谱分析，共筛选出7个可能与PIESP2直接相互作用的候选蛋白分子。这些分子是否可以与PIESP2直接相互作用尚需要进一步实验。最后，我们通过转录组测序发现PIESP2可以导致BMEC细胞中的ICAM1等粘附分子的增加，同时，细胞中的促炎信号通路被激活，细胞形态由鹅卵石样向间充质样形态改变，说明PIESP2可以活化脑微血管内皮细胞，并有可能改变BMEC间的通透性。此外，在本项目的支持下，我们建立了基于二代与三代测序技术的病原体检测方法及相应的分析系统，有利于快速准确鉴定出神经系统感染的病原体。