猪红细胞免疫粘附分子的研究

课题组对猪等动物红细胞（RBC）免疫功能及其调控进行了近10年的研究，是国内系统开展此项研究的团队之一。课题组从细胞水平证实动物RBC具有免疫粘附功能，但国内外的研究尚不能阐明动物RBC免疫粘附的分子基础及其机制。项目以猪RBC为研究对象，采用蛋白芯片技术定性分析RBC免疫粘附受体的蛋白特性、杂交瘤技术制备该受体的McAb，Western-blot定性分析该受体特异性、膜分布状态，结合流式细胞术进行该受体的统计学定量分析，基因克隆及FISH技术进行该受体编码基因的生物信息学分析及染色体定位，从蛋白和基因水平揭示猪RBC免疫粘附功能的物质基础；实时荧光照相技术动态观察猪巨噬细胞体外吞噬RBC所粘附报告菌株的过程，探索猪RBC清除免疫复合物的机制。本研究将"红细胞免疫系统"概念引入兽医免疫学研究领域，为阐明动物红细胞免疫粘附的生理、病理学意义以及调控红细胞免疫粘附功能并应用于临床奠定理论基础。

红细胞免疫功能的变化与疾病的发生、发展、转归有高度的相关性。I型补体受体（CR1）是红细胞免疫功能的主要分子基础，在红细胞粘附致敏抗原、递呈循环复合物等生理活动中扮演着重要的角色。兽医学领域中关于动物红细胞免疫粘附的分子基础、红细胞清除免疫复合物（IC）的机理及其在预防和控制动物疾病中的作用等研究近乎空白，极大限制了动物红细胞免疫理论在兽医临床实践中的应用。本项目针对“鉴定猪红细胞免疫粘附分子基础”这一科学问题进行研究。. 在研期间，课题组运用荧光免疫细胞化学技术、免疫电镜技术、qRT-PCR、Western-blot、流式细胞术、基因克隆及真核表达等，对猪红细胞免疫粘附功能进行了研究。通过比对数据库中不同物种补体调控蛋白家族相关基因信息，应用基因克隆等技术获得了猪红细胞的类补体受体（CR1-like）的cDNA信息，并合成多肽制备出相应的McAb，成功突破了限制项目研究的关键技术难题。在此基础之上，研究了猪红细胞CR1-like在猪红细胞表面的分布状态、猪红细胞CR1-like对猪红细胞免疫粘附及免疫递呈功能的介导作用，探讨了CR1-like发挥作用的影响因素，分离鉴定了猪红细胞表面的CR1-like分子，用真核表达系统对猪CR1-like的cDNA的8个胞外功能区进行了串联表达，并证明了表达产物的免疫活性。本项目初步阐明猪红细胞免疫粘附功能的分子机制：猪红细胞能够免疫粘附新鲜血清致敏的抗原，体外条件下可与巨噬细胞相互作用并将所粘附的致敏抗原递呈于巨噬细胞，表明猪红细胞具有天然免疫细胞的功能，其膜表面的CR1-like是猪红细胞免疫功能的分子基础。天然状态下，CR1-like散在分布于猪红细胞膜表面，具有补体结合活性。抗原经新鲜血清补体致敏处理后形成IC，CR1-like通过结合血清补体C3b介导猪红细胞粘附IC；CR1-like功能的正常发挥依赖于血清补体的活性，并以猪红细胞膜的流动性为生理学基础。研究中，课题组首次克隆得到猪CR1-like基因的相关信息，并成功建立猪CR1-like胞外区的串联表达体系，表明猪红细胞免疫理论亦具有遗传学基础。. 项目发表相关论文6篇，其中SCI收录4篇（1篇为中科院GCR2区），北大中文核心期刊收录3篇。申报1项发明专利（受理号2014103085340，预计2016年4月可获得授权），培养研究生6名。