基于核酸等温扩增和多功能纳米探针的DNA甲基化检测新技术研究

DNA甲基化是肿瘤表观遗传学研究的重要内容，相关基因启动子CpG岛的甲基化状态作为潜在的肿瘤标志物具有广阔的临床应用前景。现有的DNA甲基化检测技术往往需要在不同体系中分别进行多步预处理和反应，操作步骤繁杂，分析周期长，难以在肿瘤临床诊疗中推广应用。本项目拟整合多学科多技术,利用核酸等温扩增和多功能纳米探针技术与电化学等生物传感技术有机结合，在同一传感界面集成靶序列的捕获富集、甲基化特异性甄别、多重信号放大以及定量检测；通过滚环扩增技术、核酸酶技术、单核苷酸引物延伸反应和纳米磁性富集、多功能纳米探针、纳米信号放大、固相载体链接化学技术；原创性的建立一系列不依赖传统PCR扩增和/或重亚硫酸盐转化，简单、快速、灵敏的DNA甲基化定量检测新技术；为肿瘤表观遗传学研究提供新的实用工具，为推动DNA甲基化标志物在临床诊疗中的推广应用，实现肿瘤的个体化诊疗提供有力的技术支撑。

项目实施以来，以电化学生物传感技术为平台，利用电化学传感技术、等温核酸扩增技术和多功能纳米探针技术，本项目建立了一系列高灵敏特异性DNA甲基化、DNA、蛋白标志物电化学传感新方法，并将其用于DNA甲基化及其他核酸、蛋白疾病标志物的简单超灵敏定量检测。截止目前，本项目经费支持下已发表已发表论文10篇（SCI论文8篇）。 其中第一作者SCI论文三篇包括：Biosens. Bioelectron. 2012, 36, 12-17 (2012 IF 5.602); J. Electroanal. Chem. 2012, 687, 89-94(2012 IF 2.905); Biosens. Bioelectron. 2014, 62, 274-279 (2013 IF 6.451)。另外还有两篇工作已经完成，正在撰写或投稿。主要研究内容包括：.（1）DNA甲基化超灵敏电化学传感器的研制及其在分泌型卷曲相关蛋白2(Sfrp-2)基因启动子甲基化检测中的应用。本项目以SFRP-2为靶基因，建立了一种甲基化特异性电化学传感新方法。该方法能够从非甲基化DNA中灵敏的检测出含量低至0.01%甲基化DNA。并能够成功用于乳腺癌病人组织SFRP-2启动子甲基化状态的定量检测和药物诱导过程中靶基因甲基化状态变化的定量评估。本方法建立的超灵敏的DNA甲基化定量检测新方法有望成为抑癌基因启动子甲基化肿瘤标志物检测新的技术平台。.（2）本项目建立了一种新的基于分子信标介导循环链扩增的分析方法并将其与核酸滚环扩增技术结合；构建了一种超灵敏高特异性DNA电化学传感新方法。实现了DNA靶分子的简单超灵敏高特异性DNA电化学传感。本方法可以进一步发展成为DNA甲基化检测的新方法用于抑癌基因启动子甲基化的方便、超灵敏定量检测。.（3）本项目基于靶向诱导转录扩增发展了一种超灵敏电化学DNA传感器，将DNA的等温扩增过程和传感器表面靶分子的捕获过程集成到同一体系中。实现了DNA的快速超灵敏检测。并成功用于DNA甲基化的定量检测。.（4）基于核酸等温扩增的电化学蛋白标志物检测新方法。本项目建立了一种新的基于核酸适体靶向识别诱导循环链置换的电化学传感新策略，并用于蛋白标志物的超灵敏检测。该方法检测VEGF的灵敏度可达0.82 pg mL-1，为肿瘤标志物的超灵敏检测提供了新的技术支持。