等温扩增“一步法”RNA检测新技术研究

At present, RNA detection methods require two steps of reverse transcription and cDNA amplification, which are not suitable for on-site rapid detection because of complex procedures. Here, we present a new isothermal method to detect RNA by one step at a constant temperature, and vibrio parahaemolyticus from marine is used as a model target to show the feasibility of our method. This strategy makes use of innate reverse transcriptase activity of Bst DNA polymerase, coupling with nicking enzyme, polymerase and two primers, to establish a new method of isothermal exponential amplification for RNA direct detection, finally fluorescent signal is achieved by molecular beacons..The advantages of this strategy are as following: true isothermal detection throughout experiment, avoiding the repeated heating procedure of PCR; one-step and rapid detection of RNA without requiring reverse transcription. The success of this technique will provide a reference for the development of new RNA rapid detection methods, present a new amplification technology platform for point-of-care testing (POCT) and microfluidic chip, and will have important significance in molecular biology, molecular diagnosis and inspection and quarantine.

目前，RNA的检测方法大多需要RNA反转录和cDNA扩增两个步骤，这非常不利于当前对于现场快速检测的需求。本研究拟建立一种等温条件下“一步法”快速检测RNA的新方法，并以常见海洋致病菌—副溶血性弧菌作为检测靶标进行方法的验证。该技术利用本课题组发现的Bst DNA聚合酶具有内在的反转录酶活性，可以反转录RNA得到有效cDNA的能力，再在切刻酶、聚合酶和两条引物的共同作用下进行检测信号的指数式放大，最终利用分子信标进行特异性荧光信号的采集，实现对RNA靶标分子一步、等温和特异性检测的目的。.该技术的优点：检测全过程等温，避免了PCR过程中的反复升降温过程；不需要额外的反转录步骤，实现了RNA的“一步法”快速检测。本技术的建立将为RNA的快速实时检测提供新的方法学参考，为即时检测和微流控芯片提供新的扩增技术平台。该技术的成功也将在分子生物学、分子诊断和检验检疫等方面具有重要的意义。

病毒和细菌是威胁人类健康的重要危险病原体，尤其是正在肆虐的新冠病毒已经对全球人类健康造成了重要影响，如何实现对病毒和细菌的RNA“一步法”快速检测具有至关重要的意义，对突发疫情的控制将起到重要的作用。在本基金的支持下，本项目利用本课题组已成功发现的Bst DNA 聚合酶的反转录活性，成功构建了RNA一步法等温扩增新方法，实现了对副溶血性弧菌以及食品中其他致病微生物和病毒的简单、灵敏、快速检测，相对于现有市场上的血清培养法和免疫法表现出了较大优势，圆满完成了项目任务。.本研究利用Bst DNA聚合酶的反转录酶活性，首先反转录RNA得到有效cDNA，然后在切刻酶、聚合酶和两条引物的共同作用下进行检测信号的指数式放大，最终利用分子信标进行特异性荧光信号的采集，实现对RNA靶标分子一步、等温和特异性检测的目的。本项目分别应用SYBR Green I检测方法以及三种分子信标检测方案对提取的副溶血性弧菌特征RNA进行定量检测；同时应用其它弧菌属如溶藻弧菌等的特征RNA进行方法的特异性验证。根据定量及特异性检测结果进行实验的优化，筛选出了最优的检测方案，应用本研究所述方法与现行的检测标准SN/T 2424-2010和SN/T 2754.5-2011同时进行检测，对比检测的速度、灵敏度以及特异性等，进一步证明本方法的实际应用能力，实现了对以副溶血性弧菌为代表的食品安全中常见致病菌的快速灵敏检测，并研制了一系列核酸快速诊断试剂盒，将试剂盒与市面知名试剂盒进行了比较，其RNA和DNA的检出率均高于市面上公司试剂盒的检出率。该方法灵敏度高、特异性好、检测时间短、不依赖复杂仪器、操作简单、可实现即时检测，为流行病学分子诊断和食品安全的致病菌检测提供有效的技术支撑。现已在国外重要学术刊物（SCI收录）发表论文11篇，其中包括IF5.0以上的发表论文4篇（原指标为2-3篇）；培养生物化学与分子生物学快速检测领域的研究生13名（原指标为6-8名），并申请核酸检测的核心发明专利2项（原指标为1-2项）。