应力诱导人椎间盘软骨终板干细胞凋亡的信号传导研究

In our previous work, we conclusively indicated the presence of progenitor cells in degenerated cartilage endplate, and gave those cells the name as CESCs. Stress has been proved to be closely related with the degeneration of cartilage endplate (CEP) and intervertebral disc (IVD), whereas, up to now, the .molecular mechanism for stress-induced CEP/IVD degeneration has not been clarified. In our preliminary experiment, stree could induce apoptosis of CESCs, and the expression of BNIP3, a pro-apoptosis protein, was up-regulated and located in the mitochondrial membrane. In addition, bioinformatics analysis predicted that there existed the binding sites of myogenin and NRF-1 protein in BNIP3 promoter region, and the protein level of myogenin and NRF-1 was up-regulated in stress-exerted CESCs. So we make the hypothesis that myogenin and NRF-1 transcriptionly up-regulated the expression of BNIP3 in stress-exerted CESCs, then apoptosis was induced via BNIP3- mediated mitochondrial death signaling. In this study, we investigate the signaling pathway of stress-induced apoptosis of CESCs, and propose to provide a novel rationale for CEP/IVD degeneration mechanism.

前期工作中课题组发现人退变软骨终板中存在干细胞并命名为CESCs。CESCs死亡与增殖分化稳态的维持对于软骨终板结构和功能的完整性具有重要意义。已有文献报道应力与软骨终板及椎间盘的退变关系密切，然而应力所介导的软骨终板及椎间盘退变的具体分子机制尚未阐明。我们发现在应力介导下CESCs发生凋亡，且凋亡细胞中促凋亡蛋白BNIP3表达升高并定位于线粒体膜表面。此外，CESCs在应力作用下myogenin和NRF-1基因表达水平显著上调，生物信息学分析提示BNIP3启动子区存在myogenin和NRF-1的结合位点。因此，我们推测应力通过上调myogenin和NRF-1继而转录调控BNIP3的表达，最终通过线粒体途径导致CESCs发生凋亡，本研究通过体内外实验探讨在不同模式的应力条件下CESCs发生凋亡的信号转导分子机制，为软骨终板及椎间盘的退变机制提供新的理论基础。

前期工作中课题组发现人退变软骨终板中存在干细胞并命名为CESCs。CESCs 死亡与增殖分化稳态的维持对于软骨终板结构和功能的完整性具有重要意义。在本研究中，通过临床上获得退变椎间盘的软骨终板标本，成功体外分离获取人退变软骨终板原代细胞，并待人退变软骨终板细胞贴壁、扩增后，采用既往方法，应用琼脂糖悬浮培养系统从第一代细胞中筛选出CESCs。使用经过鉴定的CESCs，建立不同应力模式下的细胞应力模型，研究不同应力模式下BNIP3与细胞凋亡的关系；研究CESCs在不同应力模式下细胞生物学行为的改变及其可能的机制。在牵拉应力培养的基础上，建立营养缺失模型，研究BNIP3蛋白对CESCs凋亡的影响及可能的信号通路。研究发现，在周期性应力（15%，1Hz）的作用下CESCs 中成骨基因Runx2、成软骨基因ALP 的转录水平上调，而成软骨分化标志物SOX9 的转录水平下调，说明周期拉伸刺激促进CESCs 向成骨方向分化，而不是成软骨方向分化。同时周期性机械应力拉伸导致CESCs自噬基因Beclin-1表达上调，促凋亡蛋白BNIP3，Bak，Bax和Bcl-xl表达上调，抗凋亡蛋白Bcl-2表达下调，细胞活性降低，凋亡上升，说明周期性机械应力可能上调BNIP3的表达诱导CESCs凋亡。营养缺失导致可能通过上调CESCs中BNIP3表达增加并与线粒体结合导致线粒体膜电位下降，最终通过caspase非依赖性途径介导CESCs凋亡。本研究通过体外实验研究了在不同模式的应力条件下及营养缺失条件下CESCs 发生凋亡的信号转导分子机制，将为软骨终板及椎间盘的退变机制提供新的理论基础，并为椎间盘退变的治疗提供新的思路。