MSTN/miR-124a-2/GR通路介导猪肌肉组织特异性调控肌内脂肪细胞分化的机制研究

Elucidation of tissue-specific regulation mechanims of fat deposition in muscle is crucial for improving intramuscular fat content. Our previous study found that muscle-derived MSTN inhibited glucocorticoid receptor (GR) level in intramuscular adipocytes, which led to decreased glucocorticoid sensitivity and reduced differentiation ability of intramuscular adipocytes. Our study also revealed that miR-124a-2 was involved in MSTN inhibition of GR. In this study, we will analyze the MSTN/miR-124a-2/GR pathway in pigs, identify the Smad binding element (SBE) and miRNA binding site (miRBS). Pig preadipocyte cell lines will be established by immortalizing SV cells derived from Erhualian pigs. Mutant preadipocyte cell lines with SBE or miRBS knockout will then be constructed by using CRISPR/Cas9. The effect of MSTN/miR-124a-2/GR pathway on preadipocyte differentiation will be analyzed in vitro using both mutant cell lines in which the pathway is blocked by SBE or miRBS mutations. Mutant preadipocytes will then be marked with green fluorescence and injected into subcutaneous fat as well as muscle tissues to allow differentiation in vivo. Wild preadipocytes marked with red fluorescence will be used as control. With in vivo experiment, we will verify whether the interruption of MSTN/miR-124a-2/GR pathway could attenuate the inhibition of muscle on intramuscular adipocytes differentiation.

揭示肌内脂肪沉积的组织特异性调控机制是选育提高猪肌内脂肪含量的关键。我们前期研究发现，肌肉组织中MSTN能够抑制肌内脂肪细胞糖皮质激素受体（GR）的水平，下调肌内脂肪细胞糖皮质激素敏感性从而抑制其分化，miR-124a-2参与了MSTN对脂肪细胞GR的抑制。本研究首先对猪MSTN/miR-124a-2/GR通路进行解析，并鉴定通路中关键的Smad结合位点（SBE）和miRNA结合靶点（miRBS）。进而采集二花脸猪SV细胞建立前体脂肪细胞系，采用CRISPR/Cas9技术构建SBE或miRBS敲除的突变前体脂肪细胞系，体外分析阻断MSTN/miR-124a-2/GR通路对脂肪细胞分化的作用。最后采用不同荧光标记突变和野生前体脂肪细胞，等量混合注射皮下脂肪和肌肉组织，通过脂肪细胞在体分化能力研究，探讨阻断MSTN/miR-124a-2/GR通路能否解除或减弱肌肉组织对肌内脂肪细胞的抑制作用。

肌内脂肪含量是影响猪肉品质的关键因素，揭示肌内脂肪细胞的组织特异性调控机制对选育提高肌内脂肪含量具有重要意义。本项目重点解析了肌肉组织中MSTN/miR-124-3p/GR信号通路对肌内脂肪细胞的特异性抑制作用，证明肌肉组织分泌的MSTN通过促进脂肪细胞miR-124-3p表达，下调糖皮质激素受体GR水平，从而抑制肌内脂肪细胞分化。鉴定了通路中SBE1和miRBS两个关键位点，创制关键作用位点突变的基因编辑动物，从体外和在体水平证实了阻断MSTN/miR-124-3p/GR信号通路能够解除或减弱MSTN对脂肪细胞分化的抑制作用。同时发现miR-124-3p启动子区甲基化水平的差异导致MSTN/miR-124-3p/GR通路对皮下和内脏脂肪沉积具有不同的调控作用，揭示了体脂分布调控的一种新机制。进一步拓展了miR-124调控脂肪细胞分化的机制，解析了SESN3/SMAD3/miR-124/GR通路对脂肪细胞分化的调控。另外，本项目研究过程中，新发现两种影响肌内脂肪含量的内分泌调控机制，一是褪黑素Melatonin通过PKA和ERK1/2途径促进脂肪细胞中脂质水解和能量代谢水平，抑制肌内脂肪形成；二是鉴定了肌肉组织环境调控肌内脂肪细胞分化的一个新因子ACAT2，高水平的ACAT2通过胆固醇途径抑制肌内前体脂肪细胞分化。另外，新发现两个脂肪细胞分化的分子调控机制，即miR-32-5p通过靶向KLF3调控肌内与皮下脂肪差异沉积，miR-144通过靶向抑制FoxO1下调脂肪细胞分化负调控因子AdipoQ的表达，从而促进脂肪细胞分化。.本项目的研究从肌肉与脂肪细胞互作的角度，揭示了一种肌肉组织中脂肪细胞分化的组织特异性调控机制，发现了一种体脂分布调控的新机制，同时拓展了肌内脂肪的内分泌调控和分子调控机制，研究结果为生产中开发肌内脂肪含量分子选育技术和生理调控技术提供了理论基础。