通过靶向泛素化降解K-Ras癌蛋白逆转胰腺癌细胞的恶性生物学特性的研究

"靶向泛素化降解蛋白质"技术是利用泛素-蛋白酶体途径特异性降解蛋白质的原理发展而来的一门技术，该技术通过构建 "融合蛋白"E3，能在翻译后水平降解蛋白；同转录水平的 RNA干扰技术相比，该技术能更灵活快速的"敲减"靶蛋白。胰腺癌是一种高度恶性的肿瘤，癌基因k-ras点突变在其发生发展中起着关键作用。本课题选定K-Ras癌蛋白作为靶向降解的分子，筛选鉴定能与K-Ras相互作用的结合结构域，并将其与能介导蛋白质降解的F-Box和U-Box功能结构域融合构建出E3，通过真核表达系统将融合质粒转染胰腺癌细胞达到"敲减"K-Ras的目的。对转染后胰腺癌细胞的增殖、侵袭等生物学特性进行检测，同时进行裸鼠实验，观察"敲减"K-Ras后的胰腺癌细胞在体内的致瘤性，并对其分子生物学机制进行探讨。本项目试图阐述"靶向泛素化降解蛋白质"技术在胰腺癌细胞中的作用机理，以期为胰腺癌的基因治疗提供新的实验基础和方法。

胰腺癌是一种高度恶性的肿瘤，其早期发生转移，进展快以及对放化疗不敏感等特点使得预后极差。癌基因K-Ras点突变在胰腺癌的发生发展中起着关键作用，几乎所有的晚期胰腺导管腺癌中均有K-Ras癌基因突变，因此K-Ras成为治疗胰腺癌的关注靶点。“靶向泛素化降解蛋白质”技术是利用泛素-蛋白酶体途径特异性降解蛋白质的原理发展而来的一门技术，该技术通过构建“融合蛋白”E3，能在翻译后水平降解蛋白。本课题选定K-Ras癌蛋白作为靶向降解的分子，筛选鉴定能与K-Ras相互作用的结合结构域，并将其与能介导蛋白质降解的F-Box或U-Box功能结构域融合构建出E3，将该融合蛋白E3转染胰腺癌细胞达到敲减K-Ras的目的。对转染后胰腺癌细胞的增殖、侵袭等生物学特性进行检测，同时进行裸鼠实验，观察敲减K-Ras后的胰腺癌细胞在体内的致瘤性，并对其分子生物学机制进行探讨。按研究计划，我们圆满完成了：1、构建了以Ras的受体Raf-1分子的RBD+CRD片段作为能与K-Ras蛋白结合的“结合结构域”，U-Box片段作为“功能结构域”的融合型泛素连接酶E3表达载体；2、分析了该融合型泛素连接酶E3表达载体对K-Ras癌蛋白表达的影响，发现该融合型泛素连接酶E3能敲减K-Ras蛋白表达，与K-Ras蛋白结合并将其泛素化，使其通过泛素蛋白酶体途径降解；3、分析了该表达载体对胰腺癌细胞体内外生长的影响，发现其能抑制胰腺癌细胞体外增殖和集落形成，裸鼠体内移植瘤实验发现其能抑制胰腺癌细胞体内生长。上述研究成果为胰腺癌基因治疗提供了新思路，分别发表在《中国医学科学院学报》和《Molecular Cancer Therapeutics》 (IF: 5.226) 杂志上。