MSTN对肌卫星细胞和前脂肪细胞脂肪分化的差异调控机制研究

Researches indicated that MSTN had different regulation roles on the adipogenesis of Muscle satellite cells and Preadipocytes, but the reason is not clear. We conjecture that MSTN could induce the expression of MyoD to inhibit the transcription of PPARγ in Muscle satellite cells, which is incorrect in Preadipocytes. In this research, we explore whether the expressions of MyoD and PPARγ are different in Muscle satellite cells and Preadipocytes after treated by MSTN using Realtime-PCR、Western blot and Immunocytochemistry. Then we determine whether PPARγ could be inhibited by MyoD using bioinformatics, EMSA, Chip in Muscle satellite cells but not in Preadipocytes. Thus MSTN could have different functions on the adipogenesis of the two types of cells. If this hypothesis is confirmed, it will tell us why MSTN had different functions on the adipogenesis of different type of cells. The source of adiposities in the muscle and the related disease also will be resolved.

研究表明MSTN对肌内肌卫星细胞和前脂肪细胞的脂肪分化存在差异，但差异的原因并不清楚。我们推测在肌卫星细胞中MSTN通过诱导MyoD的表达，进而抑制PPARγ的转录；而在前脂肪细胞中，MSTN并不能诱导MyoD抑制PPARγ的转录，进而导致MSTN对两种细胞的脂肪分化存在差异。因此本研究中首先通过Realtime-PCR、Western blot、细胞免疫化学染色等确定两种细胞中MyoD和PPARγ表达是否存在差异；接着利用生物信息学预测、EMSA、Chip等试验确定MSTN在肌卫星细胞中是否通过上调MyoD的表达抑制PPARγ的活性，而在前脂肪细胞中MSTN并不能上调MyoD的表达抑制PPARγ转录。从而导致MSTN处理后的肌卫星细胞和前脂肪细胞脂肪分化存在差异。本项目若被证实将揭开MSTN对不同细胞类型脂肪分化差异的原因，同时还可揭示MSTN对肌内脂肪的形成影响和与之相关疾病形成原因。

肌内脂肪是影响猪肉品质的一个重要性状，之前研究表明肌内脂肪细胞可能由肌卫星细胞和前脂肪细胞分化而来。项目负责人之前研究表明MSTN可抑制肌卫星细胞的成脂分化，但不影响前脂肪细胞的成脂分化，因此推测肌内脂肪细胞可能主要由肌内的前脂肪细胞分化而来。但MSTN对这两种细胞的成脂分化差异调控机理并不清楚，本项目主要探讨MSTN如何差异调控这两种细胞的成脂分化。. 本项目首先从启动子的CpG岛甲基化、转录水平和蛋白水平分析了MSTN处理肌卫星细胞和前脂肪细胞后MyoD和PPARγ的表达情况。结果表明在肌卫星细胞中MSTN处理后PPARγ和MyoD的表达量减少，而在前脂肪细胞中，MSTN处理后PPARγ和MyoD的表达量增加。因此推测MSTN处理肌卫星细胞和前脂肪细胞后成脂分化差异的原因主要为MSTN对MyoD和PPARγ的调控存在差异造成的。. 接着生物信息学软件分析显示在PPARγ的启动子区域存在MyoD等转录因子结合位点。利用MyoD真核超表达载体与PPARγ启动子片段共转染显示MyoD可上调PPARγ启动子片段转录活性。当突变掉两个预测的MyoD结合位点后，启动子片段转录活性下调。通过EMSA和CHIP实验分别在体外和体内验证了上述两个结合位点的存在。结合前期结果推测MSTN蛋白在肌卫星细胞和前脂肪细胞中首先差异调控MyoD的表达进而MyoD通过作用于PPARγ启动子区域的结合位点差异调节PPARγ的表达。. 最后利用表达谱测序方法分析了MSTN处理猪前脂肪细胞（ADSCs）和肌卫星细胞（MSCs）后的基因表达情况。随机挑选了10个差异表达基因进行验证，定量结果与测序结果一致，表明结果可靠。从差异基因中挑选了WISP2基因和KLF6基因进一步分析。在ADSCs中通过功能获得和功能缺失表明WISP2的表达抑制脂滴形成，即WISP2对脂肪形成起到负调控作用。而在ADSCs中，功能获得和功能缺失试验表明KLF6的表达会促进脂滴形成，即KLF6对脂肪形成起到正向调控的作用。. 本项目弄清了MSTN差异调节肌卫星细胞和前脂肪细胞的成脂分化机理：在肌卫星细胞和前脂肪细胞中MSTN蛋白首先差异调控MyoD的表达，进而MyoD通过作用于PPARγ启动子区域的结合位点差异调节PPARγ的表达。项目的实施为弄清肌内脂肪细胞来源及肌内脂肪形成机理具有重要意义。