膀胱癌肿瘤微环境中分泌因子NOV通过活化WNT信号通路促进膀胱癌复发的机制研究

The incidence of bladder cancer is in the first placein our male urogenital,andbladder cancer has high relapse rate. The characteristics of bladder cancer tumordetermine that microenvironment plays a crucial role in the regulation and the process of tumor recurrence. Our previous study screened a secreted protein factor NOV, found its expression in bladder cancer tissues, and directly related to tumor recurrence. Use of recombinant proteins in vitro tumor supernatant or rNOV treatment of benign bladder tumor cell RT-4 can promote the occurrence of malignant transformation. Microarray analysis showed that, RT-4 cells were treated with high expression rNOV WNT pathway related molecule β-catenin, Wnt5a, Wnt6 and Wnt10a. By molecular biology molecular mechanisms regulating experimental study NOV WNT signaling pathway; through statistical analysis of clinical bladder tissue, serum and urine NOV In this study, we proposed the occurrence and recurrence relations verified by NOV and bladder cancer cells the prognostic value of the expression of bladder cancer recurrence.We want to investigate whether NOV can help to reduce the recurrence rate of intravesical bladder cancer byremoving the tumor microenvironment,NOV in animal experiment.This study aims to provide targets for intervention and prognosis for recurrence of bladder cancer.

膀胱癌在我国男性泌尿生殖系统肿瘤中发病率第一，且复发率极高。膀胱肿瘤的特性决定了其肿瘤微环境在肿瘤的发生及复发过程中发挥至关重要的调控作用。我们的前期研究筛选出一种分泌蛋白因子NOV，发现其在膀胱肿瘤组织中高表达，且与肿瘤的复发直接相关。使用肿瘤上清或者体外重组蛋白rNOV处理良性膀胱肿瘤细胞RT-4能明显促进其发生恶性转化。基因芯片分析提示，rNOV处理后的RT-4细胞高表达WNT通路相关分子β-catenin、Wnt5a、Wnt6和Wnt10a。在本研究中，我们拟通过细胞验证NOV与膀胱肿瘤发生及复发的关系；通过分子生物学实验研究NOV调控WNT信号通路的分子机制；通过临床统计学分析膀胱组织、血清及尿液中的NOV表达对膀胱癌复发的预后价值；通过动物实验探讨中和清除肿瘤微环境中的NOV是否能协助膀胱灌注来降低膀胱癌的复发率，以期为膀胱癌复发提供预后的靶标和干预的靶点。

NOV的高表达对于膀胱癌细胞和恶性增殖具有重要意义，重组NOV蛋白处理的RT4细胞中β-catenin和Cyclin D1的表达水平上调，细胞的增殖和侵袭能力增强，这进一步提示NOV介导Wnt信号通路活化在膀胱癌增殖和周期调控中发挥重要作用。本研究在原有基础上，从以下几个方面入手，就NOV通过肿瘤微环境促进膀胱癌恶性转化上的分子机制进行深入探讨。1、为了明确NOV在膀胱癌中的功能，我们利用TCGA 405例膀胱癌数据，分析了NOV表达与无复发生存（RFS）之间的关系，其中NOV高表达患者225例，低表达患者179例，发现NOV高表达，提示患者不良预后 （p=0.026）。2、在T2A细胞系中进行质谱检测NOV相互作用蛋白，利用NOV抗体进行IP实验，电泳分离进行银染，与IgG抗体条带对比，明确差异条带，切胶后送质谱检测，通过肽段分析，提示GRP78蛋白可能与NOV相互作用形成复合物。进一步在T2A细胞中进行免疫共沉淀（CO-IP）实验，双向IP验证二者的确存在相互作用。3、GRP78编码蛋白属于HSP70家族成员，主要定位于内质网，参与蛋白的组装和折叠，并介导蛋白在细胞内的运输和穿梭。根据结果推测GRP78与NOV相互作用，可能与NOV蛋白分泌及分泌前组装修饰相关，NOV对膀胱癌转移预后的影响是否依赖其分泌到微环境中，GRP78是否影响NOV的成功分泌，这些将有待进一步研究。总之，本课题的研究结果意义在于深入了解NOV通过肿瘤微环境促进膀胱癌恶性转化上的分子机制，为后续大规模临床样本分析膀胱组织、血浆和尿液中的NOV及其效应分子水平的临床意义以及与膀胱癌患者复发预后的相关性，开发新一代分子marker；探讨通过小干扰RNA或者特异性NOV抗体是否能协同灌注化疗药物，降低膀胱癌的复发率。上述研究结果将有助于我们理解膀胱癌复发的分子机制，并为膀胱癌的治疗提供潜在的分子靶点。