“p62-LC3-自噬途径”介导肿瘤细胞蛋白降解对抗原交叉递呈的影响及其机制探讨

抗原交叉提呈是肿瘤免疫的核心问题。.申请者认识到：①pAPC交叉递呈的抗原多肽主要源自肿瘤细胞的长寿蛋白、肿瘤细胞的自噬小体是肿瘤抗原的有效载体之一；②p62通过"p62-LC3-自噬途径"参与了泛素化蛋白的降解，但肿瘤细胞的上述途径对肿瘤抗原交叉递呈的影响尚不清楚。.本项目拟：以小鼠肝癌细胞为肿瘤模型，以KOVAK为模式抗原、HBsAg为"标记性抗原"构建"p62/Ub与HBsAg/KOVAK共表达/融合表达细胞"，作为交叉递呈的供者细胞或效应细胞的靶细胞，采用蛋白酶体抑制剂、细胞自噬诱导剂、细胞自噬抑制剂等处理细胞，并获取自噬小体作为肿瘤抗原的载体，旨在：①探讨"p62-LC3-自噬途径"介导肿瘤细胞的蛋白降解对肿瘤抗原交叉提呈的影响及其机制、②研究p62/自噬小体靶向性肿瘤抗原诱导特异性抗肿瘤应答及其机制。将在进一步阐明肿瘤抗原交叉递呈机制的基础上，为肿瘤疫苗的设计提出新的策略。

第一部分：HBV-DRibbles疫苗及其抗HBV作用的研究：Velcade、Rapamycin和NH4Cl联合处理HepG2.2.15细胞显著增加HBV-DRibble中HBV抗原的含量。HBV-DRibbles疫苗免疫小鼠诱导产生HBV特异性体液免疫应答和细胞免疫应答，DRibbles疫苗比重组HBsAg疫苗对小鼠模型HBV感染发挥更有效的保护作用，对已建立的小鼠HBV感染也具有治疗作用。.第二部分：p62相关分子摹集泛素化蛋白及其诱导抗肿瘤免疫的研究：构建p62蛋白的原核表达载体后成功表达并纯化p62蛋白，该蛋白能摩集泛素化蛋白。实验证实，摩集的泛素化蛋白诱导免疫应答比非泛素化蛋白更具肿瘤特异性、能更特异识别肿瘤细胞，泛素化蛋白疫苗诱导免疫应答的抗肿瘤作用明显强于非泛素化蛋白。.第三部分：肝癌DRibble疫苗及其抗肝癌作用的研究：肝癌DRibble疫苗能诱导特异性免疫应答，对小鼠肝癌具有抑制生长和治疗作用，同时，DRibble疫苗对人肝癌细胞—HepG2细胞在人源化小鼠体内也具有一定的治疗效果。.第四部分：DRibble活化B细胞及其抗原提呈的研究：肿瘤来源自噬小体(DRibbles)在体内能诱导B细胞的增殖、活化，并分泌肿瘤抗原特异性抗体的分泌；体外实验进一步证实DRibbles能通过TLR2/MyD88依赖的途径诱导B细胞的增殖、活化及抗体的分泌；B细胞依赖胞膜窖(caveolae)介导的细胞内吞摄取DRibbles并递呈DRibbles抗原诱导效应T细胞的活化。