小麦矮缩病毒（WDV)致病性或症状形成相关基因的功能解析

本研究将以我国小麦上新发现的一种双生病毒-小麦矮缩病毒（Wheat dwarf virus,WDV）为对象，基于不同分离物致病性存在较大差异，比较它们在基因组结构和序列上的异同，构建WDV的全长基因组侵染性克隆，从而获得以农杆菌或基因枪介导的对寄主植物具有高效感染能力的侵染性体系。在此基础上，通过片段互换、碱基缺失及突变等构建一系列重组的侵染性克隆，寻找产生差异的关键因子，研究WDV各基因在致病性或症状形成中的功能。鉴于沉默抑制子大多为致病因子，拟利用农杆菌共浸润法，对WDV各编码基因在寄主基因沉默中的作用进行研究，筛选鉴定WDV基因组中的沉默抑制子并明确功能，利用GFP融合蛋白表达系统对WDV编码病毒沉默蛋白进行亚细胞定位，并用异源表达体系研究WDV抑制子与病毒致病性的关系，为研究WDV致病基因与寄主互作奠定基础。

小麦矮缩病毒（Wheat dwarf virus，WDV）是近年来在我国新发现的一类侵染禾本科作物的双生病毒，为双生病毒科玉米线条病毒属的成员之一，由条沙叶蝉以持久性非增殖方式传播。自1961年前捷克斯洛伐克首次发现该病毒病以来，WDV在全球范围内的危害日益猖獗，已经成为威胁欧洲、非洲以及包括中国在内的亚洲的大、小麦粮食作物生产中的主要病毒病害之一。由于WDV在我国属新发现病害，相对来说国内关于WDV的基础研究比较匮乏。本研究主要在病毒侵染性克隆致病性和病毒沉默抑制子及基于高通量技术分析小麦矮缩病毒侵染后小麦的基因表达差异等多个方面开展了研究，取得了如下结果：克隆了小麦矮缩病毒不同地区分离物的全长基因组，分析了WDV中国分离物与匈牙利分离物之间的群体结构差异；获得了小麦矮缩病毒（WDV）中国分离物全长基因组侵染性克隆表达载体，建立了WDV适生寄主与模式寄主植物的侵染性克隆体系；发现WDV的Rep以及RepA这两种复制相关蛋白存在一定程度的抑制子活性，具有抑制单链gfp和双链gfp发夹结构诱发的植物基因本位沉默和转GFP基因植株GFP基因沉默的能力，为禾本科双生病毒的新的病毒沉默抑制子；在激光共聚焦显微镜下进行观察发现RepA与GFP的融合蛋白和Rep与GFP的融合蛋白在整个细胞中积累，在细胞质和细胞核中积累量较高；利用RNA-Seq高通量测序比较了感病小麦与健康小麦基因表达差异，发现了4324个显著表达差异的基因；GO注释分析发现这些基因与小麦体内植物激素代谢、光合作用、抗氧化等生理功能相关；进一步筛选与病毒症状诱导以及植物抗病相关的23个差异表达基因进行了qPCR验证，正在对部分症状形成相关基因进行进一步功能验证。同时利用RNA-Seq测序技术对受WDV诱导的寄主小麦miRNA的表达进行了分析，对10个miRNA进行了靶基因预测以及GO功能注释，研究结果为进一步开展WDV的致病机理及小麦的抗病毒机制研究奠定基础。