小麦矮缩病毒适应异沙叶蝉传播机制的研究

During the last decade, the leafhopper transmitted Wheat dwarf virus (WDV) has become a serious problem both in China and the world.Infected plants are dwarfed,display yellow streaks and have a drastically reduced yield.Because leafhopper is the only vector of WDV,high intensity of viruliferous insect play an important role in WDV epidemics. Up to now, information on the interaction between WDV and its vector leafhopper (Psammotettix alienus) is rather scarce.In order to study the molecular mechanism of WDV transmission by P. alienus,we try to understand the circulative pathway of WDV in P. alienus by the cytobiological methods,using antibodies against each of the four proteins encoded by the single-stranded DNA genome of WDV,and then identify the insect proteins which can interact with the coat protein of WDV by yeast two hybrid system.Furthermore,the identified proteins will be anlysed using multiple methods such as selective reaction monitoring for absolute quantification of these proteins in leafhpper,Co-IP,cell and tissue co-location and RNAi.All of results will help us to understand the WDV transmission mechanism by P. alienus and provide new approach for disease control.

小麦矮缩病毒(WDV)是双生病毒科玉米线条病毒属的成员,由介体异沙叶蝉以持久性方式传播，是严重威胁麦类作物的病毒之一。该病毒拥有广泛的寄主，包括小麦、大麦、燕麦和多种禾本科杂草，在特定生态环境条件下极易暴发流行，其中介体异沙叶蝉的密度、带毒率及传毒效率的高低是影响发生流行的重要因素。本项目以我们现有的工作为基础，瞄准当前昆虫传毒机制研究的国际前沿，拟通过细胞生物学技术明确WDV在介体异沙叶蝉体内循回途径的基础上，进一步开展WDV外壳蛋白与介体蛋白组分互作水平的研究，明确参与传毒与识别的病毒基因产物和介体叶蝉体内的传毒相关蛋白，克隆相关基因，对传毒相关蛋白进行组织、细胞和亚细胞定位，介体体内与病毒粒体共定位，明确WDV与相关蛋白质在异沙叶蝉体内的互作方式和在传毒过程中的作用，阐明异沙叶蝉持久性传播WDV的分子机理，探索从根本上切断介体传播病毒的途径，控制小麦矮缩病奠定基础。

本项目以小麦矮缩病毒（WDV）及其介体异沙叶蝉为研究对象，采用免疫荧光标记法研究发现WDV在介体体内有两条循回途径：一是首次证明病毒可以通到滤室进入血淋巴再到达唾液腺；二是通过前中肠和中中肠进入血淋巴到达唾液腺。途径一只能维持数小时，起到短时快速传毒作用，途径二能维持数周起到长期传毒作用。通过重组蛋白体外结合实验发现CP蛋白能够结合叶蝉受体蛋白，从而推测CP蛋白能够介导WDV识别并结合叶蝉受体蛋白，相关学术论文已经发表在植物病理学经典刊物Phytopathology, 2014, 104:897-904。以异沙叶蝉为材料，构建得到了以pPR3-N为载体的异沙叶蝉分离泛素酵母双杂交膜系统cDNA文库，同时还构建了带有sfi I酶切位点的诱饵载体pDHB1-WDV-CP。文库筛选得到32个可能与WDV的CP发生互作的异沙叶蝉蛋白质，共转验证和β-半乳糖苷酶检测，最终得到19个蛋白质与WDV CP互作。这些蛋白参与泛素介导的蛋白水解途径、内吞作用、cAMP信号通路和模式识别受体的信号通路等过程。相关论文分别发表在中国农业科学，2015, 48(12)：2354-2363和Plos One, 2014, 9(5): e97038。采用酵母双杂交、GST沉降技术（GST-pull down）、化学发光免疫共沉淀（Co-IP）验证了ADP核糖基化因子（ARF）与病毒CP基因在活体细胞内的互作情况，并对ARF进行了组织、细胞和亚细胞定位，介体体内与病毒粒体共定位和传毒生物学测定，明确了该蛋白通过内吞过程介导WDV进入中肠细胞。部分研究结果分别发表在Scientific Reports, 2015, 5: 10971和2016, 6: 27216。项目国内外学术刊物上发表论文5篇，其中SCI论文4篇，申请专利3项，培养硕士研究生2名，博士研究生1名。相关研究结果分别在第十届国际植物病理学大会（10th ICPP Congress）和第十二届国际植物病毒流行专业委员会学术研讨会（12th ICPVE Symposium）交流。