基于冠心病血瘀证lncRNA-miRNA-mRNA调控网络探索活血化瘀中药疗效机制研究

During the occurrence and development of coronary heart disease (CHD), long noncoding RNA (lncRNA) and micro RNA (miRNA) play important roles in regulation and control. Our research group previously discovered that Blood Stasis syndrome (BSS), one of the most significant syndrome in CHD, has differentially expressed lncRNA-miRNA-mRNA interaction network, the key nodes within might be the therapeutic targets of CHD BSS. In this research, we plan to establish in vivo and in vitro models of CHD BSS, validate the abnormal expression of genes and proteins related to BSS. Furthermore, we apply Xuesaitong and shRNA lentivirus to intervene the models, exploring the impact of activating blood and removing stasis treatment on lncRNA, miRNA and mRNA. In that may we locate the therapeutic target sites and therapeutic mechanism of activating blood and removing stasis treatment from the perspective of genomics, provide scientific evidence for the activating blood and removing stasis therapy of CHD BSS, and lay groundwork for the development of biomarker and targeted therapeutic drugs for CHD BSS.

在冠心病的发生发展过程中，长链非编码RNA（long noncoding RNA, lncRNA）和微小RNA（microRNA, miRNA）具有重要的调控作用。课题组前期研究表明，冠心病血瘀证作为冠心病最重要的中医证候，存在lncRNA-miRNA-mRNA差异调控网络，其中的关键节点可能为冠心病血瘀证的治疗靶点。本课题基于前期研究，拟通过建立冠心病血瘀证细胞和动物模型，验证冠心病血瘀证病理损伤相关基因及蛋白的异常表达；进一步采用血塞通予以干预，观察活血化瘀中药治疗前后相关lncRNA、miRNA、mRNA的表达变化，将其与过表达/抑制lncRNA慢病毒转染干预进行对比，从基因组学层面定位活血化瘀药物的干预靶点及疗效机制，为冠心病血瘀证的活血化瘀治疗提供科学依据，也为后续开发冠心病血瘀证的生物标志物及靶向治疗药物初步奠定基础。

本试验旨在探讨血塞通对内皮细胞血管生成的调控作用，以及血塞通通过调控miR-3158-3p影响血管新生功能的具体机制。通过开胸＋冠状动脉结扎构建小鼠心梗模型，所有动物被随机分为6组：假手术组(Sham)，模型组(Model)，血塞通低剂量组(Low dose XST)，血塞通中剂量组(Middle dose XST)和血塞通高剂量组(High dose XST)。根据心脏超声和心脏超声选择最适剂量。结果显示High dose XST组与Model组比较发现，其小鼠的LVAW；d、LVAW；s、LVPW；d和EF均明显增加，小鼠的纤维化区域占比明显减少。血塞通治疗的动物在术后立即灌胃给药，并将miR-3158-3p mimic经尾静脉注射进入小鼠体内使动物分为四组：假手术组，模型组，model+血塞通组，model+miRNA OE+血塞通组。结果显示，与假手术组相比，模型组小鼠心脏组织中Nur77、p-PI3K、HIF1α、VEGF和COX2的蛋白表达均显著升高（P<0.01）；血塞通治疗后，小鼠心脏中这些蛋白的表达与模型组相比明显升高。Model+miRNA OE+血塞通组与Model+血塞通组相比，其小鼠心脏组织中Nur77、p-PI3K、HIF1α、VEGF和COX2的蛋白表达均降低。使用Nur77基因敲除小鼠验证血塞通通过抑制miR-3158-3p靶向Nur77促进心梗小鼠血管新生。在模型组和血塞通组中，Nur77-/-小鼠与WT小鼠相比，其心脏组织中Nur77、p-PI3K、p-mTOR、HIF1α、VEGF和COX2的蛋白表达水平均显著降低。在Model+miRNA OE+血塞通组中发现，Nur77-/-小鼠与WT小鼠相比，其心脏组织中这些蛋白的表达均无明显变化，这说明miR-3158-3p可以靶向抑制Nur77的表达。总之，血塞通通过抑制miR-3158-3p靶向Nur77促进心梗小鼠心肌血管新生。