冠心病血瘀证相关lncRNA-miRNA调控网络研究

Coronary heart disease (CHD) is a complicated disease with multiple genes and factors involved. Previous researches have shown that CHD Blood Stasis syndrome (BSS) has its unique miRNA expression profile and miRNA-mRNA interaction network. It is newly reported that lncRNA could function as competing endogenous RNA (ceRNA) to inhibit the combination of miRNA and its target mRNA to regulate the miRNA and mRNA. Promoting blood circulation and dissolving blood stasis may treat CHD BSS by balancing the dysregulation of lncRNA and miRNA. In this research we use high-throughput sequencing, bioinformatics, RNAi, qRT-PCR and Western blot to screen out and identify the lncRNA and miRNA and the lncRNA-miRNA-mRNA interaction network correlated with CHD BSS. Then we use promoting blood circulation and dissolving blood stasis medicine to intervene, hoping to elaborate the biological material basis and scientific connotation of medicine-syndrome correspondence from the perspective of epigenetics, and provide new therapeutic targets for developing new medication for CHD BSS.

冠心病是多基因多因素复杂疾病，血瘀证是其最常见证候。我们研究表明，冠心病血瘀证有特异的miRNA表达谱和miRNA-mRNA调控网络。新近研究发现，miRNA上游存在“竞争性内源RNA”（lncRNA）,通过竞争性抑制miRNA与靶基因mRNA 3’UTR的结合，发挥对miRNA和靶基因的调控作用，活血化瘀方药可能是通过改变lncRNA表达水平，恢复其相关miRNA与靶基因之间的失衡状态来治疗冠心病血瘀证。本课题拟选择冠心病血瘀证病例，利用高通量测序、细胞转染、qPCR等技术，筛选与冠心病血瘀证相关的miRNA和lncRNA基因，构建冠心病血瘀证相关lncRNA-miRNA-mRNA调控网络，并通过“以药测证”，观察活血化瘀药物对冠心病血瘀证相关lncRNA-miRNA-mRNA调控网络的影响，阐述冠心病血瘀证病证结合、方证相应理论的科学内涵，为研制治疗冠心病血瘀证的有效方药提供新靶点。

病证结合是当前中西医结合诊疗的基本模式，血瘀证作为冠心病最主要和最常见的中医证型，已被广泛运用于冠心病的临床诊疗。但是，冠心病血瘀证的客观物质基础及发生机制尚未完全阐释。有鉴于此，本课题按照“血瘀证—客观物质基础—活血化瘀—作用机制”思路，从lncRNA-miRNA-mRNA调控网络进行设计，并严格按照项目设计思路、研究方法及内容，完成了如下工作：①利用高通量测序及生物信息学方法，对冠心病血瘀证、冠心病非血瘀证和正常对照人群进行差异基因分析，获得了冠心病血瘀证相关的39个lncRNA，229个miRNA和221个mRNA。GO和KEGG通路富集分析显示，这些差异基因主要与免疫和炎症反应相关。②运用starBase、Pearson相关分析和拓扑分析，获得4个关键基因：lncRCTA-384D8.35、lncRCTB-114C7.4、lncRRP11-567M16.6和hsa-miR-3158-3p。③通过扩大样本量对关键基因及其上下游节点进行qRT-PCR验证，结果支持高通量测序和生物信息学分析的结果。④利用慢病毒介导的shRNA转染技术，实现RNA干扰，进行基因间调控关系的细胞学实验，验证了6条主要的冠心病血瘀证lncRNA-miRNA-mRNA调控网络。⑤采用临床随机双盲安慰剂对照试验，研究活血化瘀药物对以上构建的冠心病血瘀证的1条lncRCTB114C7.4-miR3656-EGR1调控网络进行干预，以药测证，反向验证了冠心病血瘀证的lncRCTB114C7.4-miR3656-EGR1网络发生机制和物质基础。⑥结合RNA干扰技术进行细胞学体外研究，进一步揭示出该调控网络中的药物作用靶点是lncRCTB114C7.4，具体调控模式为lncRCTB114C7.4↑-miR3656↓-EGR1↓，发挥的生物学功能是抑制细胞凋亡。因此，本研究结果揭示了冠心病血瘀证的lncRNA-miRNA-mRNA网络发生机制，并发现其中一条lncRCTB114C7.4-miR3656-EGR1网络参与了活血化瘀药物的治疗机制，表明lncRCTB114C7.4-miR3656-EGR1很可能是冠心病血瘀证的网状生物标志物和治疗靶标，进而从lncRNA-miRNA-mRNA的表观遗传学层面，阐释了冠心病血瘀证及方证对应的科学内涵。