基于数字基因表达谱的三七皂苷合成糖基转移酶(GT)基因的克隆与鉴定

Dammarane-type triterpenoids, the main pharmacological components in Panax notoginseng, have a great influence on the quality of P. notoginseng through contents and types. At present, study on the key enzymes related to the late steps of notoginsenoside biosynthesis is still absent. There is little scientific data for the cultivar improvement of P. notoginseng. Glycosyltransferase (GT), the last enzyme in the triterpenoids biosynthesis pathway, seriously affects the diversity of triterpenoids. After obtaining of the transcriptome profile of 4-year-old root of P. notoginseng using GS FLX sequencing, applicants utilize a technical combination of RNA-Seq, DGE, tissue-specific gene expression, phytohormone induction and Real-time PCR for the obtaining triterpene glycosyltransferases. On this basis, characterization of triterpene glycosyltransferases will be complete by heterologous expression of recombinant proteins in yeast and subsequent LC-MS analysis. The promoter and regulation sequence will be studied. This task strives to fulfill the question what role does glycosyltransferase play in the dammarane-type triterpenoids biosynthesis. This work will lay a theoretical foundation for the improvement of drug quality and production of monomer saponin using biotechnology.

达玛烷型皂苷是三七的主要药理活性成分，其含量和种类对三七品质影响很大。目前参与三七中三萜皂苷合成后期途径关键酶的研究仍为空白，三七的品质提高缺乏科学依据。糖基转移酶 (GT) 是三萜皂苷合成途径末端的酶，是决定三萜皂苷多样性的重要原因。在利用GS FLX高通量测序技术初步获取了四年生三七根中基因表达谱的基础上，申请人利用转录组分析 (mRNA-Seq) 和数字基因表达谱 (DGE) 技术，通过三七组织特异性基因表达、植物激素诱导和Real-time PCR分析获取三萜糖基转移酶基因。采用酵母异源表达及LC-MS分析鉴定参与皂苷合成的三萜糖基转移酶的功能，并对基因启动子和调控序列进行研究。本课题力图通过三七皂苷生物合成中三萜糖基转移酶基因的克隆和鉴定，明确它在三七达玛烷型皂苷生物合成中的功能，为提高栽培三七品质、开辟利用生物技术生产单体皂苷奠定理论基础。

达玛烷型皂苷是三七的主要药理活性成分，其含量和种类对三七品质影响很大。对三七中三萜皂苷合成后期途径关键酶的研究很有限。糖基转移酶 (GT) 是三萜皂苷合成途径末端的酶之一，是决定三萜皂苷多样性的重要原因。本研究采用数字基因表达谱 (DGE) 进行差异表达基因筛选、差异基因表达模式聚类分析，获得了四个组织71,625条基因序列。其中包括1966条组织特异性表达基因。利用转录组空间定量表达、诱导子处理表达特性和全长分析，获得了10条重要三萜糖基转移酶(GTs)。对已经获得的部分GT，开展了基因顺式作用元件研究。基于Genome walking技术，完成了Unigene821启动子扩增。采用双荧光素酶分析PnDDS转录因子结合位点，为关键酶的表达调控研究奠定基础。完成了四个组织药典规定皂苷定量液质分析(LC-MS/MS)，获得了主要皂苷空间代谢谱。通过序列比较、测序验证和扩增效率分析，筛选了15条基因序列用于诱导条件下最佳内参基因的鉴定。这些重要修饰酶的鉴定还在进行中。三七皂苷生物合成中后期途径关键酶的研究，将明确它在三七达玛烷型皂苷生物合成中的功能，为提高栽培三七品质、开辟利用生物技术生产单体皂苷奠定理论基础。