三七皂苷生物合成途径关键基因的克隆与调控研究

三七为人参属药用植物，全世界98%的三七药材产于云南。以三七总皂苷为主要成分的药品已逐步成为市场份额最大的防治心脑血管疾病的天然药物。由于三七生境特殊，土地利用率低，难以大面积推广种植，严重制约了三七产业的可持续发展，迫切需要加强与三七总皂苷代谢相关的基础研究工作，为借助现代生物技术手段解决三七药用资源短缺问题奠定基础。本课题以体外培养的三七细胞为研究对象，采用代谢工程研究思路，基于三萜总皂苷的一般性合成途径，以控制代谢流节点为目标，克隆三七总皂苷生物合成途径中SS、DS、CAS三个重要基因，采用基因超表达和RNAi技术研究SS、DS和CAS的功能以及代谢流正向和反向调控对三七总皂苷合成的影响，为三七总皂苷同源或异源高效表达系统的构建提供理论依据和技术参考。

三七总皂苷(Panax notoginseng total saponins, PNS)为四环三萜类物质，是三七的主要药用活性成分，在心脑血管系统等方面具有较好的药理活性。本课题利用分子生物学技术研究三七中鲨烯合成酶（SS）、达玛烯二醇合成酶（DS）和环阿齐醇合成酶（CAS）基因在皂苷生物合成途径中的作用。克隆三七中SS和DS的全长基因，构建两者的植物超表达载体，导入三七愈伤细胞。PCR检测分别获得9株SS转基因细胞系和8株DS转基因细胞系。荧光定量PCR分析显示8株SS转基因细胞系中SS的转录水平明显增加，最高增加3.25倍；7株DS转基因细胞系中DS转录水平增加，最高增加3.5倍。SS以及DS的转基因细胞系中均检测到6种单体皂苷含量及PNS含量的增加。构建CAS RNAi表达载体，导入三七细胞，PCR筛选获得阳性细胞系5株，荧光定量PCR结果显示4株细胞系中CAS基因表达量降低，DS基因表达量增加，同时细胞系中PNS及8种单体皂苷的含量提高，而甾醇含量明显低于野生型细胞系。本研究的结果初步表明SS、DS基因转录水平的提高、CAS基因转录水平的降低有利于三七皂苷的积累，由此可见SS、DS及CAS在三七皂苷生物合成中起重要作用。