三七皂苷生物合成关键酶基因PnSS、PnSE转录调控的分子机制

Triterpenoid saponins are the main chemical composition in Panax notoginseng. Previous study confirmed that squalene synthase (SS) and squalene epoxidase (SE) were the key enzymes of triterpenoid saponins biosynthesis. Transcription factors regulated the biosynthesis of ginsenosides by regulating the expression of key enzyme genes. We have cloned and located PnSS and PnSE. However, its molecular mechanism of transcription regulation was not clear. In order to further explore the relationship of the expression of PnSS and PnSE and the transcription factors, we proposed (1) Through the Genome Walking to obtain the promoter sequences of PnSS and PnSE; (2) Using Yeast one-hybrid system to get the transcription factors combined with PnSS and PnSE gene promoter sequences and predicting the function and structure. At the same time using EMSA to validate the transcription factor in vitro; (3) Through the transcription factor gene overexpression and RNAi to study of relationship of saponins accumulation and transcription factors. The project is to elucidate molecular mechanism of PnSS and PnSE transcription regulation which were key enzyme genes in saponin biosynthesis pathway. At the same time, this study is of great significance to enrich and develop molecular pharmacognosy.

三萜皂苷是三七的主要化学成分。之前的研究证实，鲨烯合成酶（SS）和鲨烯环氧酶（SE）是三萜皂苷生物合成的关键酶，关键酶基因的表达是通过转录因子进行调控的，然而三七中转录调控的分子机制尚不清楚。我们已对三七中PnSS和PnSE进行了克隆、定位和原核表达研究，为了进一步探究PnSS和PnSE的表达与转录因子关系，我们拟（1）通过染色体步移（Genome Walking）的方法获得三七PnSS和PnSE基因的启动子序列；（2）采用酵母单杂交(Y1H Golden)体系筛选与PnSS和PnSE基因启动子序列相结合的转录因子并进行功能与结构的预测分析，同时利用凝胶迁移（EMSA）对所筛选出的转录因子进行体外验证；（3）通过对转录因子基因过表达与沉默的方法研究相关转录因子和皂苷积累的关系。本项目为阐明皂苷生物合成途径关键酶基因PnSS和PnSE转录调控的分子机制提供了理论依据。

三七（Panax notoginseng (Burk.) F. H. Chen）为五加科人参属植物，为我国特有的药用植物，其主要化学成分是皂苷类化合物。鲨烯合成酶（SS）和鲨烯环氧酶（SE）是三萜皂苷生物合成途径中的关键酶，然而关键酶基因SS和SE是如何在转录水平调控皂苷的生物合成是未知的。本项目以三七中PnSS和PnSE基因启动子为研究对象，运用酵母单杂交、亚细胞定位和原核表达等技术初步阐明皂苷生物合成途径关键酶基因PnSS和PnSE转录调控的分子机制。主要研究结果如下：（1）克隆了三七中PnSS和PnSE基因的启动子，顺式作用预测结果显示其上均存在光响应元件、激素响应元件等作用元件，且启动子对外源激素存在明显响应。（2）通过酵母单杂交技术，共筛选到12条与启动子相互作用的基因及转录因子，通过生物信息学技术预测了其编码蛋白的二级结构与三级结构，酵母体内验证结果证明其相互作用的确存在。（3）亚细胞定位研究表明筛选到的COX11，DNK及MYB2基因均定位于细胞核，DCD基因定位于叶绿体中。（4）通过原核表达得到了COX11，DCD，MYB2基因编码的蛋白，均为包涵体蛋白。EMSA结果表明，MYB2蛋白可以与启动子上的MYB core和AC-element发生特异性结合，促进PnSS与PnSE基因的表达，实现调控三七皂苷生物合成。以上结果明确了MYB转录因子与调控三七皂苷合成有关，初步阐明了皂苷生物合成途径关键酶基因PnSS和PnSE转录调控的分子机制。本项目对于揭示三七皂苷代谢途径的分子机制具有重要意义，也为提高三七品质提供理论基础。