I-B型CRISPR-Cas系统引发适应的分子机制

Prokaryotic adaptive immunity relies on clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPRs) and CRISPR-associated (Cas) proteins to detect and destroy foreign nucleic acids (e.g. virus or plasmid). However, it is not clear how DNA sequences, termed protospacers, are discriminatively acquired from the virus and stored as new spacers into the CRISPR locus to guide the subsequent target interference. Recently, we showed that the primed adaptation, which hitches and cooperates with the interference pathway, could perfectly achieve the self vs. non-self discrimination through the priming-crRNA guidance and PAM recognition, whereas the molecular details remained to be elucidated. This project will focus on the molecular mechanisms for priming adaptation of the type I-B CRISPR-Cas system in haloarchaea. Combining genetic manipulation of the CRISPR DNA and Cas proteins, high-throughput analysis of new spacers and their PAMs, and single-molecule assays of the dynamic behaviors of related Cas proteins, we aim to dissect the I-B type priming adaptation process on the three key steps, i.e. the priming (to the target sequence), the bi-directional searching (for the new protospacers), and the site-specific spacer integration (into the CRISPR locus). We will focus on revealing the essential mechanistic specificities and related molecular determinants in each step, hoping to achieve deep insights into the adaptation strategy of CRISPR system, and to provide theoretical foundations for its application in phage control or in developing novel CRISPR-Cas related biotechnologies.

原核生物CRISPR-Cas系统作为一种可遗传的适应性免疫系统可特异识别并清除外源病毒或质粒。但目前人们对于该系统在适应过程中如何特异地从病毒获取DNA片段并整合到CRISPR结构中形成新的spacer的复杂机制还很不清楚。最近，本实验室在嗜盐古菌CRISPR系统对病毒的适应过程中发现的“PAM验证的引发适应机制”很好地回答了适应过程的异己区分问题，但引发适应过程的分子细节及其特异性的分子机制还有待进一步阐明。本项目以嗜盐古菌I-B型CRISPR高效引发适应系统为研究对象，聚焦于其“靶向引发”“双向寻取”和“定点整合”三个关键阶段，结合分子遗传学技术、高通量测序和体外单分子观测分析等现代分子生物学手段，深入剖析I-B型CRISPR-Cas系统的引发适应过程，重点研究其关键步骤的特异性机制的分子基础，为深刻认识CRISPR-Cas系统的适应策略及发展CRISPR-Cas相关技术提供理论依据。

本项目中，我们基于I-B型CRISPR对病毒的高效适应模型，深入解析了引发适应过程的精细分子机制，对引发适应中“靶向引发”“双向寻取”和“定点整合”等三个关键阶段进行了深入细致的研究，取得了一系列原创性研究成果。（1）关于新spacer整合进入CRISPR结构的特异性识别机制，我们发现CRISPR repeat内部两个关键motif在spacer定点整合识别过程中发挥关键作用，并首次提出了CRISPR适应机器基于这两个motif特异性识别整合位点的“双分子尺”模型（Nucleic Acids Res 2016），该工作发表不久后，很快得到了国际上其他团队在大肠杆菌中进一步的实验证实，说明该模型具有重要的普遍性意义；（2）在CRISPR机器如何从病毒DNA选取spacer的过程与机制方面，我们通过高通量测序数据揭示了spacer获取复合物对protospacer底物5’端和3’端同时存在的序列特异性识别，解释了广泛存在的spacer尺寸多态性现象，并再次证明了适应机器在病毒DNA上双向寻取spacer的模式（Nucleic Acids Res 2017）；（3）在引发适应过程鲁棒性分子基础方面，通过对crRNA分子全面系统的突变分析，揭示了crRNA在引发适应过程中分子结构的可塑性和引发功能的高效性和鲁棒性，解释了具备“引发”机制的I型CRISPR系统在自然界中具有更高丰度的可能原因（Nucleic Acids Res 2019）；（4）我们首次利用I-B型CRISPR-Cas在嗜盐古菌的多倍体基因组中实现了高效编辑（J Genet Genomics 2017），并利用I-F型CRISPR-Cas对多重耐药的临床菌株进行了高效基因组编辑（Cell Reports 2019），不仅提供了基于内源性CRISPR-Cas系统的高效基因组编辑系统，还解析了重要环境微生物生理代谢机制及多重耐药菌的耐药机制。本项目的完成，形成了对I型CRISPR-Cas系统适应机制的系统认识，并为利用内源性CRISPR系统编辑原核微生物世界提供了范例。