嗜热古菌I-A型CRISPR-Cas系统原发适应的分子机制

CRISPR-Cas system encodes the prokaryotic adaptive immune system that provides immunity against the invasion by mobile genetic elements. The adaptation process of CRISPR-Cas system acquires new spacers from non-self DNA into CRISPR arrays. The applicant’s recent study reveals Csa3a is the crucial transcriptional regulator activating CRISPR de novo adaptation in the archaeon Sulfolobus (Liu et al., 2015, Nucleic Acids Res). But the mechanisms involved in the process remains elusive. For example, proteins essential for de novo adaptation and their specific functions in this process have not been systematically studied. Base on our own results, we will identify the essential Cas proteins, DNA polymerases and DNA repair proteins, and study their specific functions on de novo adaptation of foreign DNA into CRISPR arrays. We will further identify the proteins involved in de novo adaptation-mediated immune escape and characterize the mutation properties at CRISPR-Cas loci or protospacer regions. The research aims to reveal the specific functions and cooperation of the essential adaptation Cas, DNA polymerase and DNA repair proteins, and discovery the rules controlling the immune escape mutation during de novo adaptaion process in Sulfolobus Type I-A CRISPR-Cas system.

CRISPR-Cas是原核生物用来抵御病毒等外源遗传物质入侵的一种获得性免疫系统；其免疫适应是将异己DNA加工、整合到CRISPR位点形成新间隔序列的过程。申报人最新成果揭示Csa3a是激活嗜热古菌硫化叶菌I-A型CRISPR-Cas系统原发适应（de novo adaptation）的关键调控蛋白（Liu et al., 2015, NAR）。但在该系统中参与外源DNA加工、整合等步骤的必需蛋白尚未得到鉴定和系统的功能研究。在此项目中申请人将鉴定硫化叶菌I-A系统参与原发适应的必需Cas和DNA复制、修复蛋白，研究其在该过程中加工、整合外源DNA和聚合DNA缺口的功能。并分析原发适应必需的Cas蛋白造成CRISPR-Cas或靶标DNA突变的规律。通过该项目研究，我们将揭示硫化叶菌I-A系统在原发适应过程中Cas蛋白与DNA复制、修复蛋白的协调工作机制，及必需Cas蛋白介导的逃逸突变机制。

CRISPR-Cas是原核生物用来抵御病毒等外源遗传物质入侵的一种获得性免疫系统；其免疫适应是将异己DNA加工、整合到CRISPR位点形成新间隔序列的过程。该系统中参与外源DNA加工、整合等步骤的必需蛋白尚未得到鉴定和系统的功能研究。.本研究鉴定了S. islandicus的CRISPR-Cas系统原发适应的必需基因，包括csa1，cas1，cas2和cas4等。DNA损伤修复基因mre11等为生长必需基因不能敲除；而DNA聚合酶基因可以敲除，但为适应非必需基因，敲除后对CRISPR原发适应无影响。鉴定了Csa3a和Csa3b调控蛋白对上述CRISPR适应基因、DNA损伤修复基因和CRISPR RNA转录的直接调控作用。相关成果发表在Nucleic Acids Research和Frontiers in Microbiology杂志上（Liu T et al., 2017；Ye Q et al., 2020）。上述研究全面完善了CRISPR免疫适应的调控机制，揭示了CRISPR因子Csa3的全局性调控作用。同时，项目组深入的分析了Csa3a调控蛋白对DNA损伤修复的调控作用，揭示了CRISPR自靶向损伤后，Csa3a调控细胞聚集和细胞间DNA传递用于修复基因组DNA损伤的机制，相关成果发表在Nucleic Acids Research杂志上（Liu Z et al., 2020）。该研究首次揭示了CRISPR自靶向切割自身基因组DNA后维持其稳定性的机制。.本研究鉴定了Cas4家族蛋白是CRISPR适应必需的，该蛋白控制在间隔序列（spacer）整合的方向、长度和对PAM序列的识别。项目组同时发现S. islandicus的病毒也编码cas4基因；在其细胞中过表达病毒来源的cas4基因显著降低CRISPR适应效率。因此我们推测病毒编码cas4基因形式anti-CRISPR的功能。相关成果发表在Journal of Bacteriology杂志（Zhang et al., 2019）。该成果既阐述了Cas4家族蛋白对I-A型CRISPR-Cas系统免疫适应的重要性，又首次揭示了免疫适应阶段的anti-CRISPR机制。