冰岛硫化叶菌III-B型CRISPR-Cas系统靶标RNA激活DNase活性的分子机制

The CRISPR-Cas system is the prokaryotic adaptive immunity that protects archaea and bacteria against invasion of viruses and plasmids. The system specifically eliminates nucleic acid invaders in a small guide RNA-dependent manner. Studying molecular mechanisms of different CRISPR-Cas systems has become one of the hottest research fields in contemporary biology. Research in the applicant group in the past few years has revealed that the type III CRISPR system (Cmr-α) has both RNA interference and RNA-activated DNA interference activity in Sulfolobus islandicus (Peng et al., 2015, Nucleic Acids Res; Han et al., 2017, Nucleic Acids Res), however, the molecular mechanisms involved in the process remain to be illustrated. In this project, we will employ the genetic and biochemical methods recently developed in our group to conduct the described research, i.e. constructing S. islandicus cmr gene mutants using the endogenous CRISPR-based genome editing (Li et al., 2016, Nucleic Acids Res) and using the RNA and DNA cleavage assay to analyze Cmr ribonucleoprotein (RNP) complexes purified from wild-type strain and cmr mutants. We aim to reveal the mechanism of RNP complex assembly, capture of target RNA and the conformation change of RNP complex to activate the DNA cleavage which activated by target RNA.

CRISPR-Cas系统是原核生物所特有的获得性免疫系统，它在古菌和细菌中由向导RNA介导，来消灭外源核酸物质。对不同CRISPR-Cas系统分子机制的研究已经成为当前生物学研究领域的热点之一。近年来，申请人先后揭示了冰岛硫化叶菌III-B型CRISPR系统（Cmr-α）既有RNA干涉活性也有靶标RNA激活的DNA干涉活性（Peng et al., 2015, NAR; Han et al., 2017, NAR），但是其分子机理还有待深入研究。在本申请项目中，申请人将利用前期开发的基于内源CRISPR系统的基因组编辑技术（Li et al., 2016, NAR）构建冰岛硫化叶菌cmr基因突变株，并分析其Cmr-α系统RNP复合物的RNA和DNA切割活性。我们将解析Cmr-α复合物的组装及其识别靶标RNA的机制；并揭示由靶标RNA的结合促发RNP复合物构象变化进而激活DNA切割的机理。

本课题组是国际上最早从事CRISPR生物学研究的实验室之一。我们以硫化叶菌的CRISPR-Cas系统为模式，揭示了I型CRISPR免疫系统具有的依赖于PAM的抗病毒活性；首次揭示了III型CRISPR-Cas的依赖于靶标DNA转录的抗病毒活性以及RNA和DNA双重干涉活性。在这个面上项目里，我们致力于系统地研究硫化叶菌IIIB型CRISPR-Cas系统结构与功能的关系。研究方法包括本实验室所创建的内源CRISPR基因编辑法，基于CRISPR质粒的RNase酶活检测和基于干涉质粒DNase酶活等遗传分析；采用分离纯化同源表达的效应复合物进行生化分析以及结构生物学分析来研究III型CRISPR系统抗病毒的生化机制以及分子机制。硫化叶菌的Cmr-a系统所形成的效应复合物含有6个不同的Cmr亚基和一个crRNA。我们的研究发现：1. Cmr1a亚基通过与crRNA结合而成为效应复合物的一部分，在识别靶标RNA中起重要作用，对效应子复合物的活性也有重要的调控作用；2. 我们鉴定出了能激活Cmr-a系统RNP复合物DNA切割活性的最短长度的靶标RNA，确定了靶标RNA上对激活RNP复合物DNA切割活性的关键区域，完成RNP复合物对靶标RNA结合机制的研究； 3. 对其Cas10的Palm结构域功能分析首次揭示Cmr-a具有靶标RNA激活的次级信号分子合成活性。所合成的信号分子被鉴定为cA4（环四腺苷酸），且进一步揭示该信号分子可与Csx1的CARF结构域相互作用，变构调控其HEPN结构域的核酸酶活性；4. 与丹麦哥本哈根大学的结构生物学团队合作完成了Cmr-b复合物的结构分析，首次揭示了III-B免疫系统的抗病毒的分子机制以及其所有6个不同亚基的结构与功能的相关性；5. 我们发现了一个新型的III-A型CRISPR-Cas系统，这就是保加利亚乳杆菌IIIA型免疫系统，该系统具有很强的靶标RNA激活的DNase活性，不具备信号分子合成活性。我们还在世界上首次揭示了III型CRISPR免疫系统靶标RNA激活的DNase活性的机制及其生物学功能。研究成果包括发表了科技论文12篇（7篇IF >10）；参编了两部外文专著；获批了一项中国发明专利，即采用内源CRISPR系统进行基因编辑的新方法；申请了两项中国发明专利，即多基因编辑方法和基于III型CRISPR系统的核酸检测新方法。