双菌两步法产3-羟基丙酸机制解析及高效体系构建

3-Hydroxypropionic acid is considered as an important building block either for organic synthesis or high performance polymers. In our previous work, a two-step process was developed for 3-hydroxypropionic acid biosynthesis from glycerol using Klebsiella pneumonia and Gluconobacter oxydans. In the first step, glycerol was fermented by K. pneumonia to form 1,3-propanediol. In the second step, 1,3-propanediol was converted into 3-hydroxypropionic acid by G. oxydans. Results showed that the formation rate and conversion ratio of 3-hydroxypropionic acid from 1,3-propanediol in the second step were the most important factors limiting the yield of 3-hydroxypropionic acid. Improvement of the process is difficult because the mechanism of 1,3-propanediol metabolic in G. oxydans remains unclear. This project aims to reveal the 3-hydroxypropionic acid and the by-product formation pathways in G. oxydans by enzymology analysis, gene-knockouts and genetic complements. In the work, the genes coding the enzymes involved in the metabolism of 1,3-propanediol will be screened by bioinformatics analysis. Then the genes will be cloned and expressed in E. coli. Gene- knockout and genetic complements will be carried out in G. oxydans, to investigate the function of the genes in 3-hydroxypropionic acid or by-products formation. Based on the results, a genetic engineering G. oxydans used in the two-step process will be constructed for efficiently convert glycerol into 3-hydroxypropionic acid. In addition, the results will afford some new enzymes with high activity on conversion 3-hydroxypropionaldehyde to 3-hydroxypropionic acid, that is important for high-titer 3-hydroxypropionci production.

3-羟基丙酸是一种重要的平台化合物，生物法制备具有良好的经济和社会效益。我们前期利用克雷伯杆菌和氧化葡萄糖酸杆菌构建了从甘油到1,3-丙二醇再到3-羟基丙酸的两段生产体系，发现氧化葡萄糖酸杆菌转化1,3-丙二醇到3-羟基丙酸的速率和转化率制约着产能的提高。体系优化却因对转化机制缺乏了解而无法深入。因此，本项目将对氧化葡萄糖酸杆菌1,3-丙二醇代谢途径进行解析：通过生物信息学分析，筛选基因组中与1,3-丙二醇代谢可能相关的酶基因；通过基因产物酶学性质研究，基因的敲除、回补实验，确定候选酶在途径中的功能。最终明确1,3-丙二醇生成3-羟基丙酸的关键酶，确定副产物丙烯酸的生成路径和关键酶。以此为理论依据，对1,3-丙二醇途径进行改造，改造菌用于两段体系，有望实现从甘油到3-羟基丙酸的高效转化。项目还可能发掘催化3-羟基丙醛到3-羟基丙酸的高活性酶，为3-羟基丙酸高产途径的构建提供重要素材。

3-羟基丙酸是一种重要的平台化合物。我们前期构建了双菌两步转化体系，本项目即对其中第二步，氧化葡萄糖酸杆菌（G. oxydans）转化1,3-丙二醇（1,3-PDO）生成3-羟基丙酸过程进行解析，主要研究内容和结果如下：.1.利用HPLC、LC-MS及GC-MS对G. oxydans转化1,3-PDO过程进行分析，确定主要产物为3-羟基丙酸，副产物为丙烯酸，中间代谢物为丙烯醛。.2. 根据代谢物分析推测产物、副产物的代谢途径。利用RAST server对G. oxydans 基因组进行分析及功能注释，筛选与3-羟基丙酸生成可能相关的酶基因15个，与丙烯酸生成相关的脱水酶基因20个，氧化还原酶15个。.3.对G.oxydans细胞进行紫外诱变，获得3-羟基丙酸/丙烯酸突变菌2株。利用RT-qPCR对突变株候选酶基因进行转录水平分析，发现膜定位的乙醇脱氢酶大亚基（adhA），小亚基（adhB）及膜定位的乙醛脱氢酶（mALDH），其mRNA 表达量与3-羟基丙酸生成相关。将adhA及aldh 进行基因敲除和回补实验，确定G. oxydans催化1,3-PDO生成3-羟基丙酸的主要酶为膜结合的乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶。.4.利用超速离心技术将G. oxydans 细胞组分分离。各组分分别转化1,3-PDO，检测丙烯酸产量，发现丙烯酸途径酶定位于细胞膜上，从而缩小备选基因范围。备选基因mRNA定量分析及基因敲除、回补实验最终确定3-羟基酰基脱水酶（3-HDD）、3-羟基癸酰基脱水酶（3-HAD）是G. oxydans转化1,3-PDO生成丙烯酸的关键酶。.5.构建乙醇脱氢酶强化菌、乙醛脱氢酶强化菌、3-羟基酰基脱水酶和3-羟基癸酰基脱水酶基因双敲除菌、脱水酶双敲除并乙醛脱氢酶强化菌。分别转化1,3-PDO，获得3-羟基丙酸产量最高菌G.oxydans DSM2003-2/△3had/△3hdd/aldh。将其应用于双菌两步体系，利用甘油产3-羟基丙酸，3-羟基丙酸产量和转化速效率均有提高。.6. 将G. oxydans的酰基脱水酶基因3had/3hdd和克雷伯杆菌来源的二醇脱水酶基因dhaB 共同导入 E.coli BL21，构建了丙烯酸全生物法合成新途径。摇瓶实验中，工程菌可利用甘油生成丙烯酸124 mg/L。