利用CRISPR/Cas9技术敲除BRAFV600E基因介导甲状腺癌再分化的作用及机制

BRAFV600E gene mutation has been demonstrated to be associated with dedifferentiation and refractory to radioiodine treatment in differentiated thyroid carcinoma (DTC). Drug resistance also exists when using the current redifferentiation strategy such as kinase inhibitors to treat radioiodine-refractory DTC. The latest research found that CRISPR/Cas9 technology can achieve precise and efficient editing of the genome specific sites. The present study is designed to investigate the effect of BRAFV600E knockout using CRISPR/Cas9 on the redifferentiation and the metabolism of iodine and glucose in authenticated thyroid carinoma cell lines harboring BRAFV600E mutation in vitro and in vivo. The effect and mechanism of such novel redifferentiation strategy will be evaluated on gene, protein and functional levels using RT-PCR, Western blotting, immunofluorescence, flow cytometry, radioisotope uptake/efflux, cologenic assay, immunohistochemistry, micro-PET, micro-SPECT, and 131I therapy. Our project aims at analyzing the feasibility of the new modality (gene therapy combined with radioiodine therapy) in the treatment of radioiodine-refractory DTC, and illustrating the relationship between BRAFV600E gene mutation and malignant phenotype of DTC.

BRAFV600E突变与甲状腺癌失分化及碘-131抵抗密切相关。包括我们团队在内的国内外研究发现激酶抑制剂等新型再分化策略均存在耐药问题。最新研究发现，CRISPR/Cas9技术能够实现基因组特定位点的精确和高效编辑。本课题拟利用CRISPR/Cas9技术敲除甲状腺癌细胞BRAFV600E突变基因，通过RT-PCR、Western blot、免疫荧光、流式细胞术、放射性核素摄取/流出、克隆形成等体外实验和免疫组化、小动物PET、SPECT显像、核素治疗等体内实验，在基因、蛋白和功能水平上评价敲除BRAFV600E基因后甲状腺癌细胞碘和葡萄糖代谢的变化，评价该新型基因治疗技术介导甲状腺癌精准再分化的效能并探索其机制，分析碘-131难治性分化型甲状腺癌治疗新模式（基因治疗联合碘-131治疗）的可行性，并进一步阐明BRAFV600E突变与甲状腺癌恶性表型之间的关系。

BRAFV600E突变与甲状腺癌失分化及碘-131抵抗密切相关，国内外研究发现激酶抑制剂等新型再分化策略均存在耐药问题。最新研究发现，CRISPR/Cas9技术能够实现基因组特定位点的精确和高效编辑。因此本课题拟利用CRISPR/Cas9技术敲除甲状腺癌细胞的BRAFV600E基因，在基因、蛋白和功能水平上评价敲除BRAFV600E基因后甲状腺癌细胞碘和葡萄糖代谢的变化，分析该新型治疗技术介导甲状腺癌精准再分化的效能及其机制，进一步阐明BRAFV600E突变与甲状腺癌恶性表型之间的关系。. 在研究中，我们顺利完成了质粒构建、病毒包装、基因测序、Western blot分析、体外核素摄取实验等研究计划。我们通过实时荧光定量PCR检测，Western blot检测，体外核素摄取实验等证明利用CRISPR/Cas9技术靶向敲除BRAFV600E基因后甲状腺乳头状癌细胞的碘代谢相关基因表达增加，NIS、Tg、TSHR、TPO的mRNA表达水平较对照组显著提高，显示出CRISPR/Cas9技术敲除BRAFV600突变基因所产生的诱导再分化效果显著。此外通过qPCR还发现，CRISPR/Cas9技术敲除BRAFV600E基因后PVL2、SRSF、RAB5c、GAMT、RXRB、ROCK2、PNPLA2、PIGQ、ERPR、EPOR、CASP10、STK11、AKT1S1、CFL1、GNAQ的表达发生了显著的提高，提示CRISPR/Cas9技术敲除BRAFV600E基因后可能通过MAPK、PI3K-Akt、钙信号通路、雌激素信号通路、Wnt信号通路、ErbB信号通路影响了甲状腺癌的再分化。. 上述实验结果为CRISPR/Cas9技术敲除BRAFV600E基因介导甲状腺癌再分化机制相关研究奠定了更为坚实的理论和实践基础。目前我们陆续在核医学、肿瘤、内分泌领域相关重要杂志上发表了部分已取得的研究成果，进一步阐明了BRAFV600E突变与甲状腺癌恶性表型之间的关系,并为后续探索RR-DTC治疗新模式(基因治疗联合碘-131治疗)的可行性奠定基础。