基于动静态联合调控与优化的甘草酸酵母全合成

Glycyrrhizin is the most important active component of Glycyrrhiza plants, with wide applications in medicinal materials, sweetening agents and cosmetics. In the present proposal, the applicant has designed three modules for synthetic production of glycyrrhizin in baker’s yeast, including FPP, β-amyrin and glycyrrhizin synthetic modules. The complexity and dynamism of organisms often lead to the mismatch of the heterologous synthetic pathway and the host as well as the imbalance of metabolic flux in the host, which prevents the efficient synthesis of the target product. To solve these problems, the static and dynamic control of functional genes and yeast cells will be conducted, including: (1) The transcriptional control through promoter selection, optimization of translational efficiency, and designing protein stability for heterologous functional genes; (2) The “in situ test and optimization” for screening and directed engineering of key enzymes in the synthetic pathway; (3) Engineering of the GAL promoter system; (4) The dynamic control for metabolic flux of 2, 3-oxidosqualene. Meanwhile, the static and dynamic control and repeated “design-build-text-analyze” will be combined for well-founded optimization, together with the quantification of products and key intermediates. The static and dynamic control can be easily applied for efficient synthesis of the other target natural products. In summary, synthetic production of glycyrrhizin in heterologous microorganism provides a novel concept for sustainable development.

甘草酸是植物甘草最主要的活性成分，具有重要的经济价值。为实现甘草酸可持续性的生产，本研究以关键中间产物为节点，设计FPP、β-香树脂及甘草酸三个合成模块，用于甘草酸的酵母全合成。鉴于跨物种间基因异源表达涉及到的众多机制差异及生物体复杂多变、难于预测性的特点，本研究拟探索“关键酶和酵母细胞的动静态联合调控与优化”对甘草酸酵母全合成的影响，包括功能基因在转录、翻译、蛋白稳定性及细胞定位的改造、生物体“原位检测及优化”、半乳糖调控系统的改造、2，3-氧化鲨烯处代谢流的动态调控等。同时，拟衔接动静态优化与中间产物积累量的分析结果，对工程菌株进行系统性的改造，探讨每步优化的理论依据。区别于传统的静态优化为主的策略，“动静态联合调控与优化”更有利于解决异源合成路径与酵母自身代谢途径之间存在的不适配、代谢流不平衡等问题，可以应用于其他重要化合物的生物合成，有助于推动高附加值天然产物人工合成产业的发展。

甘草次酸是植物甘草最主要的活性成分，具有重要的经济价值。为实现甘草次酸及其前体香树脂可持续性的生产，本研究以关键中间产物为节点，设计FPP、β-香树脂及甘草次酸三个合成模块，用于甘草次酸及其前体的酵母全合成。首先，为了提高酵母工程菌株的构建效率，基于CRISPR/Cpf1，自主设计并成功开发了两套高效的酿酒酵母基因组多重编辑工具系统，包括：（1）构建了基于CRISPR/Cpf1的双质粒酿酒酵母基因组连续编辑工具箱：pESCL-FnCpf1和pCrRNA；（2）构建了基于CRISPR/Cpf1的自剪切自克隆酿酒酵母基因组编辑工具箱：scCRISPR/Cpf1系统。基于CRISPR/Cas9，开发了一套即时连续多位点基因编辑系统，命名为Cas-3P。丰富了现有的酿酒酵母基因组基因操作工具，对酿酒酵母细胞工厂的构建具有实际应用价值。鉴于跨物种间基因异源表达涉及到的众多机制差异及生物体复杂多变、难于预测性的特点，研究了“关键酶和酵母细胞的动静态联合调控与优化”对甘草次酸酵母全合成的影响，包括功能基因在转录、翻译及细胞定位的改造、生物体“原位检测及优化”、半乳糖调控系统的改造、2，3-氧化鲨烯处代谢流的动态调控等。另外，探索了细胞器区室化对于目标产物合成的影响，涉及到内质网膜形态工程改造，线粒体的氧化还原环境，及过氧化物酶体提供萜类合成的前体。实现了具有工业化应用前景的“β-香树脂及11-酮-香树脂全合成酵母工程菌株”的构建。其中，β-香树脂在摇瓶水平产量为160mg/L，上罐浓度可达到750mg/L，这是目前报道的最高产量。11-酮-香树脂在摇瓶水平产量为85mg/L，甘草次酸摇瓶水平为20mg/L。鉴于两者的高附加值，此产量具有工业化应用的前景。研究成果可以应用于其他重要化合物的生物合成，有助于推动高附加值天然产物人工合成产业的发展。