利用CRISPR/Cas9敲除技术研究β-防御素在附睾精子成熟中的作用及其分子机制

Epididymal sperm maturation is essential for natural reproduction of male individual. it is only during transit through the epididymis that sperm acquire progressive motility and the ability of capacitation and acrosome reaction. Our previous data indicated that some epididymis-specific proteins were involved in these processes. We first reported that Bin1b, a rat epididymis-speicific β-defensin, is not limited to the killing of bacteria but also initiates sperm motility. Subsquently, we found that another rat epididymis-specific β-defensin15 (Defb15) also showed antimicrobial activity and influenced sperm motility. To date, a total of 41 rat and 38 mouse β-defensin genes have been discovered in the epididymis. Moreover, a few studies suggest that several β-defensins from human and mouse were involved in the sperm motility, capacitation and sperm-egg action. So there are theoretical and clinical significance to investigate the functions of β-defensins and their molecular mechanisms. In this project, we will study the roles of β-defensins in sperm maturation and the mechanism of their action by the aplication of the CRISPR (Clustered regularly interspaced short palindromic repeats )/Cas9 system. The expected achievements will lead the way not only towards increased understanding of male infertility, but also the development of novel and highly effective contraceptives.

精子在附睾成熟过程中获得运动、获能、顶体反应等能力是雄性个体自然生殖的必需环节。我们前期工作已发现一系列附睾表达蛋白参与了精子成熟过程，其中我们首次报道了大鼠附睾特异表达蛋白β-防御素Bin1b不仅具有抗菌活性，而且能启动精子的运动。随后我们又发现了另一个大鼠附睾特异表达蛋白β-防御素Defb15除抗菌外也能参与精子的运动调节。现在已有报道，大鼠有41个，小鼠有38个β-防御素在附睾中表达；并且也陆续发现一些人和小鼠的β-防御素参与精子运动、获能及受精过程。所以，系统性深入研究附睾中β-防御素在精子成熟特别是精子运动中的作用及其分子机制具有重要的理论和临床意义。本项目拟采用最新的CRISPR/Cas9基因敲除技术，在大鼠模型中系统性研究附睾β-防御素家族成员在精子运动等成熟功能中的作用及其分子机制。预期项目成果不仅为不孕、不育症的诊治提供新依据，还可为新型男性避孕药研制提供新靶点。

精子在附睾成熟过程中获得运动、获能、顶体反应等能力是雄性个体自然生殖的必需环节。我们前期工作已发现一系列附睾表达蛋白参与了精子成熟过程，其中我们实验室首次报道了大鼠附睾特异表达蛋白β-防御素Bin1b不仅具有抗菌活性，而且能启动精子的运动。随后我们又发现了另一个大鼠附睾特异表达蛋白β-防御素Defb15除抗菌外也能参与精子的运动调节。现在已有报道，大鼠有41个，小鼠有38个β-防御素在附睾中表达；并且也陆续发现一些人和小鼠的β-防御素参与精子运动、获能及受精过程。所以，系统性深入研究附睾中β-防御素在精子成熟特别是精子运动中的作用及其分子机制具有重要的理论和临床意义。.本项目首先采用生物信息学进行相关数据的挖掘，揭示了β-防御素（β-defensin）家族成员在附睾组织内的表达与雄激素依赖性调控特点。然后选择与人有同源性、在大鼠和人附睾头部起始区域 （ Defb42 ）或体部区域（ Defb23 、 Defb26 ）特异性高表达的β-defensin 候选基因，采用 CRISPR/Cas9 技术构建了 Defb23 KO、 Defb26 KO、 Defb42 KO、Defb23/26 KO、 Defb23/26/42 KO共计五种β-defensin家族成员单基因及联合基因敲除大鼠模型，深入研究了β-defensin调节精子成熟的功能和分子机制。结果表明，β-defensin 家族成员以一种协同作用的方式影响精子内钙离子转运，导致精子运动和顶体反应发生变化，从而发挥精子成熟的调节功能。此外，我们还发现β-defensin家族成员亦能够以协同方式在炎症中起到保护精子或者附睾的作用。项目成果为分析阐明精子运动调节机制及临床弱精症的原因提供启发；并为大鼠附睾特异性基因敲除工具开发、雄性生殖道感染研究、以及男性避孕药开发等提供重要参考。项目结题时已发表标注此项目资助批准号的SCI 研究论文9 篇，且8篇影响因子（IF）大于3.0，其中4篇IF大于 5.0；参与本项目的4名博士生均已经顺利毕业，并且获得了博士学位。