Wnt/β-catenin信号通路对AML细胞原癌基因CDX2转录调控机制研究

The up-regulation of CDX2 expression in bone marrow cells can induce malignant transformation and is closely related to pathogenesis of AML, but the mechanism of CDX2 up-regulation in AML cells is unknown. Our previous study showed that the Wnt/β-catenin pathway regulated the expression of CDX2, so we assume that one of reasons for up-regulation of CDX2 expression in AML cells may be transcriptional enhancement of CDX2 gene by Wnt/β-catenin pathway. In order to verify our assumption we would firstly discuss the effects of Wnt/β-catenin pathway activating or blocking on the transcriptional level of CDX2 by use of luciferase reporter system in AML cells, and further explore the transcriptional regulation mechanism by EMSA and ChIP methods. Then we would study the relevance among β-catenin, LEF1 and CDX2 expressions in AML patients. Last we would construct shRNA expression vectors targeting CDX2 mRNA and transfect AML cell lines, and comparison cell proliferation before and after interfering CDX2 expression to explore whether the effect of Wnt/β-catenin pahtway on cell proliferation is dependent on CDX2 gene. The results will be useful to elucidate the pathogenesis of AML resulted from CDX2 overexpression.

CDX2基因表达上调可致骨髓细胞恶性转化，与AML发病密切相关，但其上调机制尚不清楚。本课题组的前期研究显示，在AML细胞中Wnt/β-catenin信号通路调控CDX2表达，由此我们提出：Wnt/β-catenin信号通路是否通过增强CDX2基因转录而使其表达上调的？本项目拟：①通过荧光素酶报告基因、EMSA、ChIP研究Wnt/β-catenin信号通路对CDX2基因的转录调控作用及机制。②通过检测AML患者β-catenin、LEF1及CDX2表达的相关性，在AML人群中验证上述转录激活作用的存在。③通过比较CDX2基因被干扰前后Wnt/β-catenin信号通路激活对细胞增殖的影响，研究该信号通路是否依赖CDX2基因发挥作用，从生物学效应方面验证Wnt/β-catenin信号通路调控CDX2基因表达。本项目将有助于阐明AML细胞CDX2基因表达调控机制。

课题组根据前期研究结果AML患者高表达CDX2基因、激活Wnt/β-catenin信号通路可上调CDX2表达，得出Wnt/β-catenin信号通路调控CDX2表达的结论；结合Wnt/β-catenin信号通路通过β-catenin与核内转录因子TCF/LEF家族成员结合形成转录复合体调控下游靶基因表达，其中LEF1被认为是与白血病发生发展关系最密切的转录因子，提出Wnt/β-catenin信号通路通过β-catenin/LEF1转录复合体增强CDX2转录而是其表达上调的假说并加以验证。本项目检测了AML患者Wnt/β-catenin信号通路激活与转录因子LEF1以及靶基因CDX2表达的相关性，并利用双荧光素酶报告基因研究过表达LEF1对CDX2基因启动子活性的影响，结果显示LEF1虽与β-catenin表达呈正相关，但与CDX2表达无相关性；过表达转录因子LEF1对CDX2基因启动子活性无影响，证实Wnt/β-catenin信号通路不是通过β-catenin/LEF1转录复合体增强CDX2转录而是其表达上调的。课题组又研究了TCF/LEF转录因子家族其他成员TCF1、TCF3和TCF4在AML患者的表达以及与β-catenin、CDX2表达的相关性，以期寻找可能与β-catenin结合、调控CDX2表达的转录因子。结果显示TCF1与β-catenin及CDX2表达均呈正相关，但同对照组相比AML患者低表达TCF1，而且在JASPAR数据库查到的转录因子TCF1只有鼠源没有人源的，提示TCF1调控CDX2转录的可能性也比较小。课题组又研究了另一个调控基因表达的常见因素——启动子甲基化状态对CDX2 mRNA表达的影响，但在AML患者和对照组未发现CDX2基因启动子甲基化水平有差异。本项目研究明确了AML患者CDX2表达上调不是由β-catenin/LEF1转录复合体增强CDX2转录引起的，不是由CDX2启动子甲基化状态改变导致的，AML患者CDX2基因表达上调机制需要从其他方面着手进行研究。